蛋白Marker定義和用途

蛋白Marker：即蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，是一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物，像“尺子”一樣用來指示蛋白質(zhì)條帶的大小。

在Western Blot過程中，分子量Marker就像個(gè)螺絲釘一樣雖然是其中小小的一環(huán)，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用。Marker的作用主要是用來指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量精確無誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說服力，除此之外，蛋白Marker還有顯示轉(zhuǎn)膜是否成功、以及蛋白在凝膠上的電泳程度等作用，因此選擇正確的蛋白Marker也是Western Blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一。

蛋白Marker的分類

總體來說，目前最常用的蛋白Marker分為非預(yù)染蛋白Marker和預(yù)染蛋白Marker。

非預(yù)染蛋白Marker

是幾種已知分子量并純化好的蛋白質(zhì)預(yù)混液，方便不同大小的蛋白比較。非預(yù)染的Marker使用上不如預(yù)染Marker好用，因?yàn)殡娪具^程中完全看不到，電泳結(jié)束后經(jīng)過蛋白染色后才能起指示作用，無法在實(shí)驗(yàn)過程中起預(yù)示參照作用，屬于“后知后覺”型的。但是由于蛋白沒有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以比較準(zhǔn)確，可以精確判斷蛋白大小。

預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因?yàn)榛旌系臈l帶越多，越不好記，誰知道哪條是那條！數(shù)到眼都花了。所以當(dāng)看到特別濃的那幾條標(biāo)志帶就記得是哪里了。不過要記得，小帶通常都不那么容易看清楚的。在選擇上來說，當(dāng)然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。

預(yù)染蛋白Marker

預(yù)染蛋白Marker是純化好的一些蛋白，通過與染料共價(jià)耦聯(lián)后混合在一起，在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時(shí)可以直接觀察到。

預(yù)染蛋白Marker的出現(xiàn)方便了我們的實(shí)驗(yàn)，這種蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以幫助我們?cè)陔娪緯r(shí)、電泳后，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測(cè)電泳情況和估計(jì)遷移率——比如，已知垂直電泳最佳分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白進(jìn)入最佳分辨區(qū)時(shí)停止電泳以得到最佳分辨效果；如果觀察到Marker電泳異常也可以及時(shí)終止電泳；另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全，還可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量，所以吸引了許多實(shí)驗(yàn)室人員購(gòu)買預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)。

值得注意的是，預(yù)染蛋白Marker與染料共價(jià)耦聯(lián)，所以在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生某些變化，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合精確定位蛋白——不過多數(shù)情況下Marker的條帶未必能和我們的目標(biāo)蛋白完全一樣，我們得到的也不過是一種相對(duì)Marker指示的參考大小，最后都需要Western來定性，所以如果不是要區(qū)分大小相近的條帶，預(yù)染Marker還是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。

預(yù)染蛋白Marker的分類

預(yù)染蛋白Marker又分：?jiǎn)紊A(yù)染和多色預(yù)染，單色預(yù)染蛋白Marker通常會(huì)利用其中某些條帶加倍濃度加深某些條帶的粗細(xì)，來提示其大小的，方便我們快速記憶和區(qū)分各個(gè)條帶的大小。而彩色蛋白Marker則用不同的顏色來區(qū)別，就更加好辨認(rèn)啦。而且如果沉悶的電泳實(shí)驗(yàn)中跑出多彩的彩虹Marker，此時(shí)心情想必會(huì)愉快一些！?

除了上面介紹的，市面上還有一些其他類型的蛋白Marker：如熒光蛋白Marker、生物素化Marker、顯影蛋白Marker等…。

此外，蛋白Marker按分子量范圍又分為高分子量、低分子量、寬分子量幾類。檢測(cè)大分子量蛋白經(jīng)常使用到高分子量范圍Marker，檢測(cè)小蛋白甚至是一些多肽常會(huì)用到小分子量范圍Marker。如果從整個(gè)實(shí)驗(yàn)室考慮，選寬分子量、條帶分布比較均勻的Marker，這樣你的蛋白無論在哪個(gè)區(qū)間都容易判斷。

Marker的一些問題?

一、marker一定要都跑出來嗎？

比如說說明書上市7條帶，其實(shí)跑出6條帶是正常的,可能是跑的時(shí)間不夠,如果你的蛋白不是很小的話,可以等溴酚藍(lán)前沿剛跑出膠的時(shí)候再關(guān)電泳儀,這樣應(yīng)該可以有7條帶.有的時(shí)候還會(huì)跑出5條,不過只要在你的目的蛋白的上下兩個(gè)帶都跑出來了就可以了,不一定非要7條。

二、marker變成笑臉狀怎么辦？

第一，膠沒有壓片

第二膠在板的邊緣與中心的膠的流動(dòng)性可能不同，這個(gè)沒有辦法，跟黏度和表面張力有關(guān)。如果各種方法都不能解決上面的現(xiàn)象，個(gè)人建議maker換一條道上樣，選一條靠近中間的泳道跑一跑。

邊緣效應(yīng)，在邊緣兩個(gè)泳道的樣品會(huì)這樣的?？梢栽囋囯娪舅俣嚷c(diǎn)兒......

要么配膠時(shí)沒壓好，膠沒配好，要么電泳時(shí)電壓太大，電滲力強(qiáng)，要么玻板電泳時(shí)沒夾好，內(nèi)電泳液是漏的，請(qǐng)逐一排查。

三、marker條帶變寬怎么解決？

原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。

對(duì)策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15μL（即2-10μg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μL。

原因二：樣品溶解不完全。

對(duì)策：(1)樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。