今天我為大家?guī)硪黄l(fā)表在Frontiers in Oncology雜志上，影響因子為4.848的一篇分析基因家族的生信文章，之前我復現(xiàn)的一篇9分生信文章也是關于基因家族文獻，大家可以聯(lián)系起來學習，總結(jié)基因家族的生信文章所有花式湊數(shù)據(jù)的方法，爭取做到把該做的都做了，畢竟酸菜大大和雪球老師都說過如果把挑圈聯(lián)靠四個維度的數(shù)據(jù)都做滿，文章的影響因子就不會太差啦！

大家如果手上有合適的基因家族正在做濕實驗，看到本篇推文加上幾個生信圖，發(fā)到10分+還是非常有希望的。

今天復現(xiàn)的文章題目是：

要素拆解

題目：結(jié)直腸癌中CBX家族成員預后價值及免疫浸潤的綜合分析

疾病：結(jié)直腸癌

數(shù)據(jù)來源：TCGA

分析策略：基因家族+生信在線工具（表達+預后）+免疫浸潤等相關分析

思路框架

作者從CBX基因家族入手，通過表達差異分析，生存預后等分析，得到CBX3/5/6可能是CRC患者生存的潛在預后標志物，CBX5/6 mRNA高表達與直腸癌患者短總生存期(OS)相關，CBX3基因與CRC患者的臨床腫瘤分期和短無病生存期(DFS)顯著相關。

復現(xiàn)內(nèi)容

Results1: 結(jié)直腸癌患者CBXs的差異表達Results2：結(jié)直腸癌患者CBXs mRNA表達的預后價值Result 3：結(jié)直腸癌患者CBXs的基因改變、表達和相互作用分析Result 4：結(jié)直腸癌患者CBXs免疫細胞浸潤的研究

復現(xiàn)工具
◆?仙桃學術工具（https://www.xiantao.love/products）◆Oncomine數(shù)據(jù)庫（http://www.oncomine.org）◆?K-Mplotter數(shù)據(jù)庫

(http://kmplot.com/Analysis/index.php?p=background)

◆?GEPIA2數(shù)據(jù)庫

(http://gepia.cancer-pku.cn/)

◆?cBioportal數(shù)據(jù)庫（https://www.cbioportal.org/）◆?STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）◆?GeneMANIA（http://www.genemania.org）
◆?TIMER2數(shù)據(jù)庫（http://timer.comp-genomics.org/）

本文共7張大圖一張表，現(xiàn)在一切準備就緒，沒時間解釋了，快上車！跟著我一起開始復現(xiàn)之旅吧！

Figure 1

CBXs在不同癌癥中的差異表達

作者為了探討不同CBXs在結(jié)直腸癌患者中的不同表達，采用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析mRNA表達。根據(jù)Oncomine的數(shù)據(jù)，CRC組織中CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5、CBX8的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而CBX6、CBX7的轉(zhuǎn)錄水平較正常組織明顯降低

復現(xiàn)步驟：

登陸oncomine數(shù)據(jù)庫

?https://www.oncomine.org/resource/main.html

這個網(wǎng)站僅限非盈利機構郵箱可以免費注冊，免費功能一般就可滿足我們的需要，我們可以看到目前oncomine數(shù)據(jù)庫收錄了715個數(shù)據(jù)集，其中包含了86733個樣本的芯片數(shù)據(jù)，支持幾乎所有的蛋白編碼基因，部分研究比較多的非編碼RNA也能搜索到，如明星的miRNA，let-7等。

1：首先，在【search】這一欄輸入CBX1，就會在右邊展示CBX1在各個癌種中的表達情況。

2：表格上方可以選擇數(shù)據(jù)篩選條件，包括p值，變化倍數(shù)等，不過一般默認就好~但是作者在這里將P值從默認的0.05改成了0.01，大家復現(xiàn)的時候注意一下。

3：數(shù)字代表了研究數(shù)量，紅藍色代表高低表達。我們可以看到復現(xiàn)出來的結(jié)果和原文一模一樣，按照同樣的步驟，將CBX2-8分別做出來，拼接到一起，即可得到Figure 1

接著，作者在這里列出了全文中唯一一張表，讓我們來看一下如何制作這張表吧

Supplemental Table?1

CBXs在不同類型的結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達?

我們這里依然用CBX1做示范。

復現(xiàn)步驟：

1：在oncomine數(shù)據(jù)庫中輸入CBX1

2: 選擇【Differential Analysis】再選擇其中癌VS癌旁的分析

3: 【Analysis Type】選擇Colorectal Cancer VS.Normal Analysis

4：這里P-VALUE根據(jù)個人情況選擇，作者在這里選擇了0.01

5：選擇來自TCGA的數(shù)據(jù)集之后，右邊出現(xiàn)了這個數(shù)據(jù)集具體信息，比如說Fold Change2.308，p為5.78E-04，將這些信息整理成表格即可得到Table1

Figure 2

CBXs 在結(jié)直腸癌中的表達

本張圖由GEPIA在線數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）得到，GEPIA2于2020年5月份正式開放使用，是GEPIA的升級版。GEPIA2上線了多個GEPIA版本沒有的功能，在很大程度上豐富了網(wǎng)站的功能，可以幫助我們做出更多的可視化結(jié)果。比如說GEPIA2提供了自定義上傳數(shù)據(jù)分析的功能，為用戶提供個性化服務。GEPIA是唯一一個整合了TCGA和GTEx數(shù)據(jù)的在線工具，解決了TCGA數(shù)據(jù)庫的局限性（很多腫瘤類型的正常匹配樣品很少）現(xiàn)在讓我們一步一步來復現(xiàn)這張圖吧：

復現(xiàn)步驟：

1：打開GEPIA網(wǎng)址，，在【enter gene name】輸入CBX1

2：在菜單欄【Expression DIY】中選擇【profile】

3：選擇文章中研究的COAD癌種，點擊plot，即可得到文章中的圖

同樣的步驟，將CBX2-8用GEPIA畫出來，下載拼接即可得到Figure2

Figure1和Figure2是結(jié)果一里面的兩張圖，主要都是為了顯示CBX家族在結(jié)直腸癌病人中的表達情況。

那研究基因家族在腫瘤中的表達大家不要忘了還有一個神器~

那就是學的永遠沒有更新快的，地表最強【仙桃工具】啦

現(xiàn)在我們來用仙桃學術看一下如何復現(xiàn)本張圖：

這里我們依然用CBX1做示范

1：在高級版中選擇【表達差異】，再選擇【非配對樣本】

2：選擇【TCGA-COAD】數(shù)據(jù)集

3：輸入目標基因【CBX1】

4：按需選擇可視化方式，這里我們選擇默認的【箱式圖/柱狀圖】

5：點擊【確認】

即可出圖，點擊下載圖片。同樣的對CBX2-8進行分析，拼接起來?，F(xiàn)在我們有3種方法可以展示基因在結(jié)直腸癌中的表達量，分別是oncomine，GEPIA，仙桃學術工具，很明顯，用工具做出來的圖形個性化程度更高，也更加好看，小伙伴們學會了嗎？當然做表達量分析遠不止這3種方法，以后我們再根據(jù)文獻進行具體介紹。

Figure?3

CBX表達與結(jié)直腸癌腫瘤分期的相關性

對于這張圖有些小伙伴可能有些覺得不知道作者想表達什么意思，現(xiàn)在讓我們先對每個參數(shù)都進行講解，再教大家如何用2種方法進行復現(xiàn)，首先我們還是用CBX1作為示例

1：看Pr值，小于0.05有意義

2：看中心點（白點），代表基因的表達均值

3：可以對COAD進行分期

方法一GEPIA復現(xiàn)：

1：在Gene列中輸入【CBX1】

2：【Expression DIY】中選擇【Stage plot】

3：【Cancer name】選擇【COAD】

4：Plot color按照個人喜好選擇，作者這里選了紅色

5：點擊【plot】出圖，然后下載。

這個小提琴圖告訴我們，在腫瘤發(fā)展的不同時期，該基因表達無明顯差異，可以推測，該基因?qū)δ[瘤預后意義不大。同樣的方法，可以將CBX2-8補齊，拼接成Figure3。

方法二仙桃學術復現(xiàn)：

1：高級版仙桃學術，選擇【臨床意義（靠）】

2：選擇【臨床相關性】

3：癌種選擇【結(jié)腸癌】

4：選擇【臨床-Pathologic.stage】分成Stage I，Stage II，StageIII，StageIV四組

5：基因輸入【CBX1】

6：點擊確認。

得到的結(jié)果和GEPIA結(jié)果類似，證明了在腫瘤發(fā)展的不同時期，該基因表達無明顯差異。和GEPIA得到結(jié)果一致。

Figure 4

結(jié)直腸癌中CBXs表達的預后價值

現(xiàn)在，我們來看一下Figure4：作者探究了CBX家族基因和生存之間的關系。

本圖依然是由GEPIA在線數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）得到，我們一步一步來復現(xiàn)：這里依然用CBX1為例

方法一GEPIA：

1：菜單欄選擇【Survival】

2：Gene輸入【CBX1】

3：【Methods】選擇【Overall Survival】，或者選擇【Disease Free Survical即RFS】就可得到原文中關于CBX1的兩張生存圖。

3: Datasets Selection輸入【COAD】

4：點擊【Plot】

Logrank是經(jīng)典的比較生存曲線差異的算法，一般認為P<0.05有顯著差異，這里p=0.85，不顯著，說明CBX1和生存無關。

方法二仙桃學術：

1：仙桃學術選擇【臨床意義（靠）】

2：下拉菜單選擇【預后分析】--【KM曲線圖】

3：選擇【COAD結(jié)腸癌】

4：輸入基因【CBX1】

5：【預后類型】這里先選擇OS，隨后選擇RFS

5：點擊確認，同樣的步驟得到CBX2-8拼接起來即可得到Figure4

Figure 5

CBXs在直腸癌中的預后價值

接著，我們來復現(xiàn)Figure5，本圖作者依然是為了證明CBX家族和生存之間是否有相關性。

作者用了Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫。這個數(shù)據(jù)庫是一個生存分析的在線工具，最初是設計用來對肝癌中的miRNA進行生存分析，后來在此基礎上進一步拓展，目前支持21種腫瘤類型，包括miRNA和mRNA的生存分析，用法很簡單，我們這里還用CBX1舉例，復現(xiàn)步驟具體如下

1：因為Kaplan-Meier plotter分析gene chip只包括【Breast cancer】，【Ovarian cancer】，【Lung cancer】，【gastric cancer】，而作者研究的是COAD，所以需要選擇RNA-seq的泛癌數(shù)據(jù)。

2：Gene symbol輸入【CBX1】

3：這里選擇【OS】

4：選擇癌種【Rectum adenocarcinoma】

5：【Draw Kaplan-Meier plot】即可出圖

結(jié)果和原文一模一樣。至此，我們現(xiàn)在學會了用3種方法做基因生存分析，小伙伴在做自己課題的時候記得每種做生存分析的方法都試一遍，選取自己想要的結(jié)果放在文章里。

Figure 6

結(jié)直腸癌中CBX的基因突變和表達分析

接下來我們來復現(xiàn)Figure6: 結(jié)直腸癌患者CBXs的基因改變、表達和相互作用分析

本張圖作者用到了cBioportal分析工具（http://www.cbioportal.org/），String數(shù)據(jù)庫，GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，我們先來簡單介紹一下cBioportal數(shù)據(jù)庫，這是探索腫瘤的基因組學特征的一個數(shù)據(jù)庫，是在DNA水平進行的，可對機制進一步研究，本數(shù)據(jù)庫不用注冊，可免費使用。這個網(wǎng)站目前存儲DNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)，mRNA，miRNA表達數(shù)據(jù)，非同義突變，蛋白質(zhì)水平和磷蛋白水平數(shù)據(jù)，DNA甲基化數(shù)據(jù)和一些有限的臨床數(shù)據(jù)等。

具體復現(xiàn)步驟如下：

A圖：

1,2：我們先看一下A圖包含了Rectal Adenocarcinoma，Colon Adenocarcinoma，Colorectal Adenocarcinoma三種數(shù)據(jù)集，所以我們進入cBioportal網(wǎng)站后，選取相對應的數(shù)據(jù)集，7個數(shù)據(jù)集加在一起正好1949個samples

3:【Select Molecular Profiles】選取Mutations、Copy number alterations

4: 輸入我們文章中的基因家族名稱

5：點擊【Submit Query】

6：菜單欄中選取【Cancer Types Summary】即可得到A圖

B圖：

7：菜單欄我們選擇【OncoPrint】，即可得到B圖，

8：我們來細看一下下圖框框里的突變比例，CBX1-8分別為0.6%，1.3%，1%，2.6%，0.8%，1%，1%，1.6%，和原文比較之后發(fā)現(xiàn)一模一樣，復現(xiàn)非常有操作性。

接著我們來復現(xiàn)Figure6C，利用String數(shù)據(jù)庫分析得到

具體步驟如下：

1：左邊菜單欄里選擇【Multiple proteins】

2：將需要研究的基因/蛋白輸進去

3：Organism選擇【Homo sapiens】

4：點擊【Search】

5：點擊【Continue】即可得到Figure6C

我們現(xiàn)在來看一下Figure6D，該圖由GeneMANIA得到。

GeneMANIA（http://www.genemania.org）的開發(fā)者來自加拿大的多倫多大學，最開始數(shù)據(jù)庫相關文章（PMID:20576703）于2010.7月發(fā)表在Nucleic Acids Research雜志上（IF=11.501），截止到2021.3.12該文章已被引用1042次，之后開發(fā)者于2013年和2018年對該數(shù)據(jù)庫進行了兩次大更新，每次更新的文章也都發(fā)表在了Nucleic Acids Research雜志上。

該數(shù)據(jù)庫用于生成有關基因功能的假設，分析基因列表和為功能分析確定基因的優(yōu)先級，給定一個查詢基因列表，GeneMANIA使用大量的基因組學和蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)功能相似的基因。在這種模式下，它根據(jù)查詢的預測值對每個功能基因組數(shù)據(jù)集進行加權（以上關于GeneMANIA資料引用自解螺旋—阿波沒有羅）

復現(xiàn)步驟：

1：如圖所示，我們以網(wǎng)站默認選擇物種和網(wǎng)絡，基因列表我們輸入CBX1-8基因名，點擊后面的放大鏡進行檢索（因為回車是繼續(xù)輸入下一個基因名），

2:點擊最右邊網(wǎng)頁，第一個圈圈標出來的按鈕，加載完成就會得到和文章一模一樣的結(jié)果，即Figure6D。這個數(shù)據(jù)庫功能與string數(shù)據(jù)庫類似，但和string相比，GeneMANIA圖更加炫酷好看一些，可能更受審稿人青睞，大家可根據(jù)需要自行選擇。

Figure 7

差異表達的CBX與免疫細胞浸潤之間的相關性

下面我們來復現(xiàn)最后一張圖Figure7：在結(jié)腸癌患者中，CBX家族的免疫細胞浸潤研究。

作者是利用了TIMER數(shù)據(jù)庫分析（http://timer.cistrome.org/）

復現(xiàn)步驟：

1：在最上方菜單欄中選擇【Immune】

2：Gene Expression中輸入我們需要研究的基因名【CBX1】

3：Immune Infiltrates依次選擇【B cell，CD8+T cell， CD4+T cell，Macrophage，Neutrophil，Dendritic Cell】

4：點擊【Submit】

5：這時候出來的是泛癌，我們在【Search】欄輸入COAD，可以點進去我們想要的圖形，拼接起來即可得到Figure7

至此，本文復現(xiàn)結(jié)束，本篇文章一個非常大的優(yōu)勢在于復現(xiàn)過程中結(jié)果和作者原圖結(jié)果幾乎一致，不像大部分生信文章重復不出來一模一樣的結(jié)果，很適合新手小白進行復現(xiàn)哦。如果在復現(xiàn)過程有疑惑，歡迎大家一起討論哦！