非酒精性脂肪肝（NASH）正迅速成為肝移植和肝衰竭的首要原因。肝炎是NASH的關(guān)鍵特征，但參與這一過(guò)程的免疫通路尚未充分闡明。B細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。然而，B細(xì)胞在NASH發(fā)病機(jī)制中的作用以及導(dǎo)致它們?cè)诟闻K中激活的潛在機(jī)制尚不清楚。美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Xavier Revelo教授等研究團(tuán)隊(duì)在Hepatology（IF 17.425）上發(fā)表了一項(xiàng)題為“Microbiota‐driven activation?of intrahepatic B cells aggravates NASH through innate and adaptive signaling”的研究，該研究從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組出發(fā)，并結(jié)合腸道菌群的多樣性，運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合，系統(tǒng)闡述腸道微生物群驅(qū)動(dòng)的B細(xì)胞積累和活化會(huì)在NASH進(jìn)展過(guò)程中通過(guò)先天性和適應(yīng)性免疫機(jī)制導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化。

?研究材料

高脂肪高碳水化合物飲食小鼠模型（HFHC）、正常飲食小鼠（NCD）、B細(xì)胞缺陷型μMT小鼠、B細(xì)胞特異性缺失MyD88 (B-MYD) 的小鼠、Nur77-GFP小鼠、FMT小鼠

?技術(shù)路線

步驟1：HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟中存在促炎性B細(xì)胞的聚集和活化，而B(niǎo)細(xì)胞缺陷小鼠的肝臟炎癥和纖維化得到改善；

步驟2：MyD88是B細(xì)胞在NASH過(guò)程中促進(jìn)肝臟炎癥、纖維化和損傷所必需的；

步驟3：NASH中的B細(xì)胞活化受到B細(xì)胞受體信號(hào)，提示B細(xì)胞活化整合了天然免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制;

步驟4：移植NASH患者糞菌增加了受體小鼠肝臟中的B細(xì)胞積累和活化，從而加劇NASH，提示腸道菌群因素驅(qū)動(dòng)了B細(xì)胞在NASH中的致病性。

?研究結(jié)果

1. B細(xì)胞在NASH中的動(dòng)態(tài)變化

為了確定肝內(nèi)B細(xì)胞在NASH進(jìn)展中的作用，作者用HFHC飲食誘導(dǎo)小鼠NASH，并分離出免疫細(xì)胞后識(shí)別主要的免疫細(xì)胞群，HFHC組的B細(xì)胞顯著增加。為了評(píng)估B細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)情況，作者發(fā)現(xiàn)分別在丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）和脂多糖（LPS）刺激后，NASH小鼠表達(dá)TNF-α和IL-6的B細(xì)胞數(shù)量增加。同時(shí)，來(lái)自NASH小鼠的B細(xì)胞也顯示出細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I類和II類以及CD86的上調(diào)，這表明活化和抗原呈遞能力增加。以上結(jié)果表明，NASH小鼠中肝內(nèi)B細(xì)胞積累，并釋放促炎細(xì)胞因子以及呈遞抗原的能力增加。

2. NASH小鼠肝內(nèi)B細(xì)胞顯示促炎基因譜

為了更好地了解NASH如何改變B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜，作者對(duì)來(lái)自NCD和HFHC肝臟的免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)24個(gè)CD45+免疫細(xì)胞簇。作者主要關(guān)注了B細(xì)胞簇的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)炎癥基因Il1b、S100a8等在HFHC肝臟B細(xì)胞中表達(dá)增加。為了驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)B細(xì)胞表達(dá)譜的檢測(cè)能力，作者還對(duì)HFHC和NCD小鼠肝臟B細(xì)胞進(jìn)行了常規(guī)RNA-seq，同樣驗(yàn)證了幾個(gè)促炎基因在HFHC肝臟B細(xì)胞中上調(diào)。為了解釋這些數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義，作者使用 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)參與炎癥和TLR信號(hào)傳導(dǎo)的上游調(diào)節(jié)因子的激活，以及IL10RA和SOCS1的抑制，并且富集到活躍的炎癥途徑。以上結(jié)果顯示NASH小鼠的B細(xì)胞活化和炎癥表型增加。

3. ?B細(xì)胞缺陷可改善NASH

為了確定B細(xì)胞是否在NASH的發(fā)病機(jī)制中起直接作用，作者評(píng)估了HFHC喂養(yǎng)的B細(xì)胞缺陷μMT小鼠的NASH進(jìn)展。HFHC μMT小鼠顯示出NAS評(píng)分較低，且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在HFHC μMT小鼠中，促炎基因的表達(dá)顯著降低，B細(xì)胞數(shù)目顯著減少，并且HFHC μMT小鼠纖維化明顯減少，纖維化形成基因表達(dá)降低，而這些變化在NCD WT和NCD μMT小鼠中并未檢測(cè)到，該結(jié)果說(shuō)明在HFHC喂養(yǎng)后，B細(xì)胞可以引起代謝和炎癥紊亂。

4.??促炎基因MyD88介導(dǎo)NASH中B細(xì)胞的促炎功能

RNA-seq分析確定MyD88是HFHC小鼠肝B細(xì)胞中促炎基因的上游調(diào)節(jié)因子，為了研究B細(xì)胞固有的MyD88信號(hào)傳導(dǎo)是否影響NASH進(jìn)展，作者構(gòu)建了B細(xì)胞特異性缺失 MyD88 (B-MYD) 的小鼠，HFHC喂養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)B-MYD HFHC小鼠NAS評(píng)分較低。雖然B-MYD HFHC和WT HFHC小鼠之間的總數(shù)和亞群免疫細(xì)胞群沒(méi)有差異，但B-MYD HFHC小鼠的肝內(nèi)B細(xì)胞MHC-I和MHC-II減少，這表明TLR介導(dǎo)的激活降低了抗原的呈遞能力。以上結(jié)果表明，B細(xì)胞需要MyD88來(lái)促進(jìn)NASH的肝臟炎癥、纖維化和損傷。

5. ?BCR刺激激活肝內(nèi)B細(xì)胞

BCR與抗原結(jié)合產(chǎn)生的激活信號(hào)是B細(xì)胞活化的第一信號(hào)，接下來(lái)作者探究了在NASH過(guò)程中肝內(nèi)B細(xì)胞的激活是否與BCR信號(hào)有關(guān)，因BCR信號(hào)傳導(dǎo)在Nur77基因的控制下誘導(dǎo)綠色熒光蛋白 (GFP) 表達(dá)，作者給Nur77-GFP小鼠喂食NCD或HFHC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFHC Nur77-GFP小鼠的GFP+肝內(nèi)B細(xì)胞的頻率和數(shù)量顯著增加，表明在NASH期間的激活涉及肝臟中的BCR信號(hào)。該結(jié)果表明，NASH中，B細(xì)胞的活化受到BCR信號(hào)刺激。

6. ?腸源性微生物因子促進(jìn)肝內(nèi)B細(xì)胞活化

為了研究NAFLD相關(guān)菌群失調(diào)產(chǎn)生的細(xì)菌產(chǎn)物是否促進(jìn)肝內(nèi)B細(xì)胞活化，作者構(gòu)建了FMT小鼠模型，與健康FMT小鼠相比，NAFLD FMT小鼠表現(xiàn)出擬桿菌門和變形菌門豐度增加，該結(jié)果與NAFLD供體的菌群比例具有高度相似性。且NAFLD FMT小鼠NAS評(píng)分略有增加，肝內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量增加，抗原呈遞和共刺激分子的表達(dá)增加，纖維化輕微增加。這些數(shù)據(jù)表明，腸道菌群中與NAFLD相關(guān)的變化足以誘導(dǎo)肝臟中B細(xì)胞的積累和活化，同時(shí)將肝臟病理學(xué)的各個(gè)方面從人類供體傳遞給受體小鼠。

?結(jié)論

文章首先通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ASH樣本進(jìn)行免疫分析，發(fā)現(xiàn)促炎B細(xì)胞在NASH樣本中顯著積累，隨后作者利用B細(xì)胞缺陷型小鼠模型證明了B細(xì)胞在NASH進(jìn)展中的重要性，接下來(lái)作者相繼證明了B細(xì)胞促炎表型受到MyD88和BCR信號(hào)的調(diào)節(jié)刺激。通過(guò)FMT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了NASH患者腸道菌群的改變可以導(dǎo)致肝臟中B細(xì)胞積累和激活。文章運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合，系統(tǒng)的闡釋了腸道菌群對(duì)NASH的影響，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床上具有深遠(yuǎn)的意義。