摘 要

????????隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，整合了環(huán)境DNA、DNA條形碼和高通量測(cè)序的 eDNA?宏條形碼技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，同過取樣環(huán)境DNA利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析對(duì)取樣環(huán)境的某物種或物種豐富度進(jìn)行檢測(cè)。雖然其準(zhǔn)確性易受數(shù)據(jù)庫質(zhì)量影響，但自身取樣方便、檢測(cè)范圍廣、通量高等特點(diǎn)符合當(dāng)前的研究趨勢(shì)。結(jié)合已報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)，本文論述eDNA宏條形碼技術(shù)的常規(guī)操作流程和在實(shí)際中的應(yīng)用，并對(duì)未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：Environmental DNA;條形碼;高通量測(cè)序;物種檢測(cè)

1.?引言

????????eDNA（Environmental DNA），是在沒有預(yù)先分離任何目標(biāo)生物的情況下從環(huán)境樣本中捕獲的DNA，eDNA可以從現(xiàn)代環(huán)境（如海水、淡水、土壤或空氣）或古代環(huán)境（如沉積物、冰或永久凍土中的巖心）獲得。該詞最早可追溯到1987年，在當(dāng)時(shí)是用來調(diào)查沉積物中微生物的一種方法。如今，在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的研究中都可以看到eDNA方法的使用。

????????DNA宏條形碼（Metabarcoding）是條形碼（Barcoding）與高通量測(cè)序（High-throughput sequencing，NGS）的結(jié)合，選取條形碼序列的一段（如COI的某段序列，100~200bp）作為分子標(biāo)記，將混合樣本（如eDNA、群落DNA）作為模板，擴(kuò)增完成后進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果后再進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將每條正確的測(cè)序序列與不同物種一一對(duì)應(yīng)。

????????人類基因組計(jì)劃推動(dòng)了測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，2000年初，第一個(gè)真正的高通量測(cè)序平臺(tái)發(fā)布，再歷經(jīng)20多年的發(fā)展，測(cè)序成本早已不像當(dāng)初那樣昂貴，因此高通量測(cè)序的應(yīng)用更加廣泛[1]。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展是推動(dòng)eDNA宏條形碼技術(shù)成為研究熱門的重要因素，同時(shí)，利用DNA條形碼來鑒定物種時(shí)，只需要一小段DNA，這也正好避開了高通量測(cè)序在長片段測(cè)序方面的劣勢(shì)。

????????eDNA宏條形碼技術(shù)可用于研究物種豐富度評(píng)估和單一物種檢測(cè)，已報(bào)道文獻(xiàn)中，研究對(duì)象包括植物[2]、動(dòng)物[3]和微生物[4]，在進(jìn)行單一物種檢測(cè)時(shí)，高通量測(cè)序幾乎派不上用場(chǎng)，但需要根據(jù)檢測(cè)的物種設(shè)計(jì)特異性探針。eDNA宏條形碼技術(shù)還可能獲得我們意料之外的結(jié)果，如檢測(cè)到還未在本地報(bào)道過的生物的DNA，或許本地真的存在這種生物，只是還未被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)也有可能是測(cè)序錯(cuò)誤以及數(shù)據(jù)庫中的同源性序列存在錯(cuò)誤。eDNA宏條形碼技術(shù)和其它技術(shù)一樣也有自身的局限性，確保eDNA的質(zhì)量、降低測(cè)序成本、擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫信息將進(jìn)一步推進(jìn)eDNA宏條形碼的發(fā)展。

2.?eDNA宏條形碼技術(shù)的基本流程

????????基于二代測(cè)序的高通量eDNA宏條形碼技術(shù)可分為三個(gè)流程采樣流程、測(cè)序流程和分析流程。在進(jìn)行eDNA取樣時(shí)，不同的生境取樣方式存在區(qū)別，但目的都是為了獲取無脊椎動(dòng)物殘留在環(huán)境中的DNA，液體樣最后都需要經(jīng)過過濾裝置，使DNA吸附到濾膜上，王月等在研究中發(fā)現(xiàn)使用混合纖維素膜吸附DNA后續(xù)得到的PCR產(chǎn)物最多[5]。若初始樣品為非液體，則需要用其它方法，如對(duì)于糞便樣品，可購買糞便樣品DNA提取試劑盒來使用[6]。在PCR擴(kuò)增中常將eDNA中的DNA條形碼序列的某一段作為模板，選擇合適的引物，引物可以自己設(shè)計(jì)也可從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲得。擴(kuò)增體系、擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)、各種溫度則需要根據(jù)文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室經(jīng)驗(yàn)來摸索。

????????在獲取一定質(zhì)量和數(shù)量的DNA后，可進(jìn)入接下來的測(cè)序流程。目前Illumina公司生產(chǎn)的二代測(cè)序儀仍然為市場(chǎng)主流，二代測(cè)序的特點(diǎn)是邊合成邊測(cè)序，測(cè)序前給每段序列加上標(biāo)簽，經(jīng)橋式PCR將不同序列進(jìn)行擴(kuò)增，形成不同的簇，簇是為了放大脫氧核糖核酸核苷酸（dNTP）所帶的熒光信號(hào)。不同的dNTP帶不同的熒光信號(hào)，在其3’端還攜帶一個(gè)阻礙合成的基團(tuán)，按順序記錄不同的熒光，獲得測(cè)序結(jié)果。

????????測(cè)序結(jié)果并不能直接使用，需要進(jìn)行初步分析，如是否有序列過度出現(xiàn)、是否存在嵌合體等。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選后，將余下相似性較高的序列（>97%）看作一個(gè)OTU（operational taxonomic units），多個(gè)OTU可能對(duì)應(yīng)一個(gè)物種。隨后將不同序列在數(shù)據(jù)庫（如ncbi，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己搭建的數(shù)據(jù)庫）中進(jìn)行比對(duì)，盡量將每條序列鑒定到最小分類單位。

3.?eDNA宏條形碼的應(yīng)用

3.1.?物種豐富度檢測(cè)

????????物種多樣性是反應(yīng)生態(tài)系統(tǒng)是否穩(wěn)定的一個(gè)重要指標(biāo)，良好的生態(tài)系統(tǒng)可以創(chuàng)造不菲的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而外來物種入侵[7]、自然災(zāi)害[8]和人類活動(dòng)[9]都可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，僅在2016-2018年期間中央財(cái)政在重點(diǎn)生態(tài)保護(hù)修復(fù)專項(xiàng)中就撥款260億元。在生態(tài)環(huán)境的評(píng)估中常利用無脊椎動(dòng)物，因?yàn)樗鼈兊膫€(gè)體小，種類龐大，當(dāng)利用eDNA宏條形碼技術(shù)時(shí)，從2ml試管水樣中，就能獲得大量的無脊椎動(dòng)物信息，這些無脊椎動(dòng)物大部分來自昆蟲綱。昆蟲是動(dòng)物界第一大門的第一大綱，昆蟲已知種類數(shù)量多達(dá)100多萬種，據(jù)推測(cè)，整個(gè)昆蟲群體可能有1000多萬種，甚至可能是3000多萬種。歷經(jīng)數(shù)億年的演化，昆蟲家族的成員在習(xí)性與食性上出現(xiàn)了巨大差異，因此幾乎任何一種生態(tài)系統(tǒng)中都有多種昆蟲存在，但海洋除外，科學(xué)家猜想是由于海洋上并不存在為昆蟲提供棲息地的植物[10]。

????????在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，水環(huán)境是被研究的最多的，水可以有效的溶解生物個(gè)體釋放到環(huán)境中的DNA，同時(shí)水體取樣也相對(duì)方便，魚類多樣性監(jiān)測(cè)相關(guān)文章中涉及到eDNA宏條形碼技術(shù)的比例正在逐年上升[11]。在獲取昆蟲等其它體積微小的動(dòng)物的eDNA時(shí)并不容易，在采樣牛糞時(shí)就可能無法剔除一些微小的蟲卵[6]。群落DNA（Community DNA）可以彌補(bǔ)這一缺陷，從環(huán)境樣品（如土壤或水）中提取生物體個(gè)體，再將個(gè)體進(jìn)行混合后提取的總DNA，該技術(shù)被稱為群落DNA宏條形碼技術(shù)（Community DNA metabarcoding），除了獲取DNA的方式有所區(qū)別，后面的分析流程一致。實(shí)際上，這些被用于提取群落DNA的個(gè)體也可能攜帶一些非自身DNA，即群落DNA中含有eDNA。收集群落DNA要相對(duì)簡單，如利用昆蟲誘集燈采樣結(jié)合宏條形碼技術(shù)來比較不同生境下的昆蟲多樣性[12]。Zhenhua Sun等使用網(wǎng)掃和陷阱誘集從水底獲得樣本經(jīng)形態(tài)鑒定后再將它們統(tǒng)一浸制在70%乙醇中，隨后抽濾酒精吸附酒精中的DNA通過宏條形碼技術(shù)研究距公路不同距離的池塘中大型無脊椎動(dòng)物的組成差異[13]。

3.2.?單一物種檢測(cè)

????????物種監(jiān)測(cè)可用來追蹤和發(fā)現(xiàn)一些稀有物種，以便我們更好的摸查和保護(hù)這些稀有資源，同樣是在水環(huán)境，eDNA可被用來監(jiān)測(cè)長江江豚（Neophocaenaphocaenoidesasaeorientalis）[14]。紅外相機(jī)是在野外調(diào)查大型脊椎動(dòng)物時(shí)常用的方法[15]，但紅外相機(jī)不容易拍到一些極稀有物種，拍攝過程中容易受人類放牧活動(dòng)影響。可以通過昆蟲等無脊椎動(dòng)物特殊的習(xí)性如食糞、食腐、寄生吸血等特點(diǎn)來從這些無脊椎動(dòng)物中獲得脊椎動(dòng)物的DNA，達(dá)到監(jiān)測(cè)的目的[16]。在2012年，科學(xué)家提出通過熱帶水蛭來獲取有亞洲獨(dú)角獸之稱中南大羚（Pseudoryx nghetinhensis）的DNA，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究[17]。

????????除了用于尋找稀有保護(hù)動(dòng)物的蹤跡，eDNA還被用來監(jiān)測(cè)外來物種的入侵。在2003年-2016間我國正式公布的入侵害蟲有26種，僅稻水象甲每年危害水稻面積約15萬公頃，造成經(jīng)濟(jì)損失約4.3億元。蟲災(zāi)的爆發(fā)需要昆蟲的種群密度達(dá)到一定值，如蝗災(zāi)的爆發(fā)需要每平方米存在6-10只蝗蟲。若我們?cè)谖锓N入侵的早期就檢測(cè)到它的存在就能及時(shí)準(zhǔn)備好應(yīng)對(duì)措施，降低損失。目視調(diào)查是野外早期調(diào)查的常用調(diào)查方法，但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且嚴(yán)重受外界環(huán)境影響以及昆蟲個(gè)體大小影響?，F(xiàn)在有利用eDNA來檢測(cè)入侵害蟲的相關(guān)案例，在斑衣蠟蟬（Lycorma delicatula）入侵美國北部時(shí)，Rafael E. Valentin等人根據(jù)其在取食植物汁液時(shí)排出蜜露這一特點(diǎn)利用，利用滾輪法和噴霧法收集其蜜露，最后利用特異性探針成功檢測(cè)到斑衣蠟蟬DNA[18]。

4.?討論

????????eDNA宏條形碼技術(shù)是一種迅速興起的方法，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法目前的一些不足。無論是物種豐富度評(píng)估還是單一物種檢測(cè)，傳統(tǒng)分類需要采集大量樣本并通過形態(tài)學(xué)鑒定將每一個(gè)個(gè)體鑒定到科、屬、種，這不僅需要過硬的專業(yè)知識(shí)，而且要在采樣和整理樣本的過程中耗費(fèi)大量時(shí)間。在進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定時(shí)還要求個(gè)體必須完整，而對(duì)于個(gè)體微小和特征不明顯的昆蟲，傳統(tǒng)分類方法則可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。eDNA宏條形碼技術(shù)也有自身的局限性，如下：1.DNA在周圍環(huán)境中的留存時(shí)間，不同的生物體釋放DNA到環(huán)境中的速率不同，同時(shí)DNA在不同環(huán)境中的降解速率也不同；2.eDNA在采樣、提取和儲(chǔ)存過程中易受污染；3.物種特異性DNA條形碼的可用性取決于已有數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量，在多數(shù)研究中，一些物種只能確定到科或?qū)偈且驗(yàn)閿?shù)據(jù)庫中比對(duì)到的序列沒有鑒定到種，而且在NCBI中，DNA條形碼大部分為COI序列，其它類型的DNA條形碼序列相對(duì)缺乏；等。

????????eDNA宏條形碼技術(shù)的廣泛使用與測(cè)序技術(shù)的發(fā)展息息相關(guān)，一代測(cè)序和三代測(cè)序由于通量低、成本高、測(cè)序準(zhǔn)確度低等缺點(diǎn)在eDNA宏條形碼技術(shù)的使用中并不多，二代測(cè)序（NGS），不僅可以檢測(cè)到環(huán)境中含量非常低的eDNA，而且可在一個(gè)樣本中同時(shí)分析數(shù)千個(gè)物種。對(duì)于NGS得到的大量序列數(shù)據(jù)我們需通過計(jì)算機(jī)工具來處理，也就是最后的生物信息學(xué)分析，生信分析是研究人員面臨的最大困境之一，它要求從事分類學(xué)家掌握一定的計(jì)算機(jī)信息知識(shí)，一些圖形化界面可能降低了難度，但同時(shí)占用了更多的系統(tǒng)資源，也降低了計(jì)算機(jī)的工作效率。目前已有公司提供eDNA測(cè)序服務(wù)，如Illumina和國內(nèi)的上海凌恩生物科技有限公司，他們只需要你提供最初的DNA樣本就能幫你完成后續(xù)操作，包括生信分析后的數(shù)據(jù)可視化展示。但價(jià)格不菲，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室并沒有充足的經(jīng)費(fèi)來持續(xù)購買公司的服務(wù)，畢竟去野外采樣等其它方面都需要經(jīng)費(fèi)的支持。

????????具有非侵入性取樣、通量大、省時(shí)高效等優(yōu)勢(shì)的eDNA宏條形碼技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。特別是在昆蟲多樣性的調(diào)查中，它能在采樣和整理樣本中節(jié)省大量時(shí)間，但目前的公共數(shù)據(jù)庫中序列的數(shù)量與質(zhì)量并不能滿足我們的需求，我們需要通過傳統(tǒng)分類方法來證明eDNA宏條形碼技術(shù)獲得的結(jié)果的確是可靠的。

參考文獻(xiàn)

[1] Goodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.?Nat Rev Genet?17,?333–351 (2016).

[2] Danziger Ariella M.,Olson Zachary H.,Frederich Markus. Limitations of eDNA analysis ??for Carcinus maenas abundance estimations[J]. BMC Ecology and Evolution,2022,22(1).

[3] 王夢(mèng),楊鑫,王維,段聰,劉智皓,陳啟亮,李英文,沈彥君.基于eDNA技術(shù)的長江上游珍稀特有???魚類國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)重慶段魚類多樣性研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2022,46(01):2-16.

[4] Feist Sheena M.,Lance Richard F.. Genetic detection of freshwater harmful algal blooms: A review focused on the use of environmental DNA (eDNA) in Microcystis aeruginosa and Prymnesium parvum[J]. Harmful Algae,2021,110.

[5] 王月,劉煥章,李莎,俞丹.基于微滴式數(shù)字PCR方法的魚類環(huán)境DNA樣本處理與保存技術(shù)優(yōu)化[J].水生生物學(xué)報(bào),2022,46(03):332-341.

[6] Sigsgaard Eva Egelyng,et al. Environmental DNA metabarcoding of cow dung reveals taxonomic and functional diversity of invertebrate assemblages.[J]. Molecular ecology,2020,30(13).

[7] 章家恩,趙本良,羅明珠,何銘謙,宋春秀.外來生物福壽螺入侵的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其評(píng)價(jià)探討[J]佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,28(05):1-6.

[8] 舒洋,孫子瑜,張恒.世界森林雷擊火研究現(xiàn)狀和展望[J].世界林業(yè)研究,2022,35(02):34-40.

[9] 楊林林.過度捕撈和其他人類壓力正嚴(yán)重?fù)p害海洋保護(hù)區(qū)[J].漁業(yè)信息與戰(zhàn)略,2021,36(04):302-303.

[10] 為什么昆蟲不涉足海洋[J].中國科技獎(jiǎng)勵(lì),2007(11):60.

[11] Shuping Wang,et al. Methodology of Fish eDNA and its Applications in Ecology and ? ? ? ? ? ?????Environment[J]. Science of the Total Environment,2020,755(P2).

[12] Zenker Mauricio M,Specht Alexandre,Fonseca Vera G. Assessing insect biodiversity ??????with automatic light traps in Brazil: Pearls and pitfalls of metabarcoding samples in? ? ? ? ? ? ? ? ? ?preservative ethanol.[J]. Ecology and evolution,2020,10(5).

[13] Sun Zhenhua,et al. DNA metabarcoding adds valuable information for management ????????????of?biodiversity in roadside stormwater ponds.[J]. Ecology and evolution,2019,9(17).

[14] 吳昀晟,唐永凱,李建林,劉凱,李紅霞,王欽,俞菊華,徐跑.環(huán)境DNA在長江江豚監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2019,26(01):124-132.

[15] 郭楨杉,黃金燕,張群艷,吳沛樺,張晉東.基于紅外相機(jī)的中國獸類多樣性監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀分析[J].?四川林業(yè)科技,2022,43(03):60-66.

[16] Massey Aimee L,et al. Invertebrates for vertebrate biodiversity monitoring: comparisons using three insect taxa as iDNA samplers.[J]. Molecular ecology resources,2021,22(3).

[17] Callaway, E. A bloody boon for conservation.?Nature?484,?424–425 (2012). ?????????

[18] Valentin Rafael E,et al. Moving eDNA surveys onto land: Strategies for active ????????????????????????eDNA?aggregation to detect invasive forest insects.[J]. Molecular ecology

????????resources,2020,??20(3).