單克隆抗體制備是細(xì)胞免疫學(xué)的一個(gè)重要里程碑，它涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)檢測等各個(gè)方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。

經(jīng)在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。

只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。

三、試劑與器材：

細(xì)胞培養(yǎng)板、解剖器械、平皿、酶標(biāo)儀、加樣器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。

四、操作方法：

1、抗原制備；

2、免疫動(dòng)物；

3、免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；

4、細(xì)胞融合；

5、雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；

6、雜交瘤細(xì)胞的篩選；

7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化；

8、單克隆抗體的檢定；

9、分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；

10、單克隆抗體的大量制備。

五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)：

1、整個(gè)制備過程需嚴(yán)格無菌

2、細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)注意適時(shí)更換培養(yǎng)液