寫在前面

????????今天推薦的是由大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究所在2019年12月20日發(fā)表于Cell Death & Differentiation（IF：15.828，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Chuanchun Han教授，研究表明去泛素化酶USP10調(diào)節(jié)KLF4穩(wěn)定性并抑制肺腫瘤發(fā)生。

研究背景

????????Krüppel樣因子4 (KLF4) 是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，是參與多種侵襲性癌癥進(jìn)展的多功能參與者。蛋白酶體依賴性途徑是在翻譯后水平控制KLF4豐度的主要方式之一。盡管已經(jīng)鑒定了一些泛素連接酶，但KLF4的去泛素酶和調(diào)節(jié)功能仍未得到探索。

摘要部分

????????在這里，通過篩選可能與KLF4相互作用的泛素特異性蛋白酶，作者發(fā)現(xiàn)泛素特異性肽酶 10 (USP10) 作為KLF4的去泛素化酶。USP10的過表達(dá)通過阻斷KLF4的降解顯著增加KLF4蛋白水平，而USP10的敲低促進(jìn)KLF4降解，從而增強腫瘤發(fā)生。小鼠中USP10的缺失會下調(diào)KLF4表達(dá)并加速KrasG12D驅(qū)動的肺腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。此外，作者的數(shù)據(jù)顯示，KLF4可以通過直接結(jié)合TIMP3啟動子來促進(jìn)腫瘤抑制基因TIMP3的轉(zhuǎn)錄。臨床上，USP10表達(dá)的降低，伴隨著癌組織中KLF4和TIMP3豐度的降低，預(yù)示著肺癌患者的預(yù)后不良?？傊?，作者的結(jié)果表明USP10是KLF4的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，將USP10-KLF4-TIMP3軸確定為肺癌有潛力的治療靶點。

研究內(nèi)容

1.USP10增強KLF4表達(dá)??? ? ?

????????為了篩選可能調(diào)節(jié)KLF4穩(wěn)定性的潛在DUB，作者在HEK293T細(xì)胞系中與GFP-KLF4一起表達(dá)了各種DUB。實驗表明，在HEK293T細(xì)胞中，USP10的共表達(dá)顯著增加了KLF4蛋白水平，而非其他USP。為了進(jìn)一步證實這一點，作者在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)USP10并發(fā)現(xiàn)USP10的異位表達(dá)導(dǎo)致KLF4升高。相反，USP10的敲低（KD）降低了肺癌細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞（HBE）中的KLF4蛋白水平。? ? ?

????????接下來，作者檢查了KLF4蛋白水平的增加是否依賴于USP10的去泛素化酶活性。野生型USP10而非CA突變體增加了KLF4蛋白水平。這些結(jié)果也在使用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立的USP10敲除 (KO) 肺癌細(xì)胞中得到證實。作者發(fā)現(xiàn)野生型USP10而非CA突變體的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了USP10KO對KLF4的減少。

????????為了進(jìn)一步研究USP10對體內(nèi)KLF4表達(dá)的影響，引入了Loxp-Cre策略介導(dǎo)的USP10小鼠的全身敲除。與之前的報告一致，Usp10-/-小鼠在出生后一天內(nèi)死亡。作者解剖并收集了USP10 WT和KO小鼠出生時的各種組織。發(fā)現(xiàn)小鼠中USP10的缺失顯著降低了肺、肌肉和脾臟組織中KLF4的表達(dá)。類似地，在來自USP10 KO小鼠的MEF細(xì)胞中，KLF4蛋白水平被下調(diào)而mRNA水平不受影響。

研究結(jié)論：USP10在體內(nèi)和體外特異性地增加了KLF4蛋白水平。

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2.USP10保持KLF4穩(wěn)定性并去泛素化KLF4? ???

????????為了進(jìn)一步驗證USP10是否以蛋白酶依賴性方式影響KLF4表達(dá)，用蛋白酶體抑制劑MG132處理USP10敲低的H1299和A549細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)MG132逆轉(zhuǎn)了KLF4的下調(diào)。值得注意的是，野生型USP10而不是突變體的過表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)源性KLF4蛋白穩(wěn)定性的顯著增加。相反，USP10敲低導(dǎo)致KLF4蛋白不穩(wěn)定。

????????考慮到USP10可以作為去泛素化酶從其底物中去除泛素化，作者推斷USP10應(yīng)該通過去泛素化來調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，野生型USP10異位表達(dá)降低了KLF4的多泛素化，而USP10缺失增加了KLF4多泛素化，這可以通過引入野生型USP10回補。作者進(jìn)行了體外去泛素化測定，野生型USP10而非CA突變體在體外去除了KLF4上的Ub鏈。

研究結(jié)論：USP10控制KLF4的穩(wěn)定性并抑制其多泛素化。

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3.USP10與KLF4相互作用? ???

????????作者接下來確定USP10是否直接與KLF4相互作用。免疫共沉淀測定證實異位表達(dá)的 GFP 標(biāo)記的KLF4可以在FLAG標(biāo)記的USP10中檢測到，反之亦然。此外，純化的GST-KLF4，能夠在體外與帶 FLAG 標(biāo)簽的USP10結(jié)合，表明USP10和KLF4之間存在直接相互作用。另一方面，在H1299和A549細(xì)胞中也檢測到內(nèi)源性USP10和KLF4之間的相互作用。免疫熒光分析顯示USP10和KLF4共定位于H1299和A549細(xì)胞中。

????????KLF4作為多功能轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，KLF4的羧基末端包含三個鋅指和兩個核定位信號，可介導(dǎo)DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)亞細(xì)胞定位。作者在 HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)了帶有Flag標(biāo)簽的USP10以及KLF4的不同結(jié)構(gòu)域。免疫共沉淀分析表明KLF4的抑制域?qū)ζ渑cUSP10的物理相互作用至關(guān)重要。不僅如此，USP10的氨基末端區(qū)域（aa1-aa100）介導(dǎo)了與KLF4的物理相互作用。USP10的氨基末端缺失突變體失去了對調(diào)節(jié)KLF4蛋白水平和泛素化的作用。

研究結(jié)論：USP10是KLF4真正的相互作用蛋白

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4.USP10缺失通過下調(diào)KLF4促進(jìn)肺腫瘤發(fā)生? ? ?

????????先前的研究表明KLF4是肺癌中的重要腫瘤抑制因子，因此作者探討了USP10是否通過調(diào)節(jié)KLF4來抑制肺腫瘤的形成。為此，作者在有無USP10敲低的H1299和A549細(xì)胞中過表達(dá)KLF4。沉默USP10表達(dá)可以顯著增加肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且KLF4表達(dá)的恢復(fù)完全回補了USP10 KD引起的表型。一致地，異種移植測定表明KLF4的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)USP10缺失的影響并抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

????????為了探究USP10在體內(nèi)肺腫瘤發(fā)生中的生物學(xué)作用，作者建立了KrasG12D驅(qū)動的肺 ADC模型。通過鼻內(nèi)滴注將表達(dá)AAV-Cre-GFP的腺相關(guān)病毒遞送至KrasLSL-G12D/WT/USP10WT和KrasLSL-G12D/WT/USP10 KD小鼠以誘導(dǎo)KrasG12D蛋白的表達(dá)。作者在AAV-Cre感染后使用微計算機斷層掃描對一組成對的KrasG12D/WT/USP10 WT和KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠進(jìn)行成像。通過冠狀和橫切面成像μCT掃描，KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠在肺中顯示出比KrasG12D/WT/USP10 WT小鼠更多的可檢測結(jié)節(jié)。隨后，作者在AAV-Cre誘導(dǎo)后120天對小鼠進(jìn)行了腫瘤分析。與 KrasG12D/WT/USP10相比，KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠的腫瘤負(fù)荷和腫瘤面積顯著增加，導(dǎo)致KrasG12D/WT/USP10 KD小鼠的生存期顯著縮短和預(yù)后不良。此外，作者檢測到肺組織中的KLF4表達(dá)，發(fā)現(xiàn) KrasG12D/WT小鼠中USP10的消耗顯著降低了KLF4蛋白水平并增加了KLF4泛素化。

研究結(jié)論：表明USP10通過在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)KLF4來抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

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5.KLF4轉(zhuǎn)錄上調(diào)TIMP3表達(dá)? ???

????????為了剖析USP10對KLF4表達(dá)的影響如何抑制肺癌發(fā)生和進(jìn)展的可能分子機制，作者使用RNA-seq鑒定受USP10影響的KLF4下游基因。在通過 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對兩個基因進(jìn)行KO后，作者檢測差異表達(dá)的KLF4 KO和USP10 KO mRNA。毫不奇怪，許多差異表達(dá)的基因（58個上調(diào)和243個下調(diào)）在KLF4 KO和USP10 KO條件下表現(xiàn)出相同表達(dá)趨勢。此外，作者發(fā)現(xiàn)一些已知的腫瘤抑制基因在KLF4 KO和USP10 KO后同時下調(diào)。

????????有趣的是，通過計算 MSigDB中243個下調(diào)基因和基因集之間的重疊，發(fā)現(xiàn)TIMP3在許多代表癌癥相關(guān)生物狀態(tài)或過程的關(guān)鍵特征中顯著富集。在可以歸類到肺癌基因集中的那些下調(diào)基因中，TIMP3是排名最高的腫瘤抑制基因。隨后，分別在KLF4 KO和USP10 KO肺癌細(xì)胞中使用q-RT-PCR和western blot進(jìn)一步驗證了TIMP3下調(diào)。當(dāng)內(nèi)源性KLF4和USP10被兩個獨立的shRNA敲低時，獲得了類似的結(jié)果。KLF4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了USP10缺失導(dǎo)致的TIMP3減少。相反，當(dāng)KLF4被敲除時，USP10過表達(dá)導(dǎo)致TIMP3的增加被抑制。此外，USP10的缺失也抑制了來自USP10 KO小鼠的肺組織和MEF細(xì)胞中TIMP3的表達(dá)。

研究結(jié)論：TIMP3是USP10-KLF4通路的下游基因。

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6.USP10和KLF4通過調(diào)節(jié)TIMP3表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移

????????為了評估USP10和KLF4是否通過上調(diào)TIMP3表達(dá)抑制腫瘤發(fā)生，作者在KLF4或USP10耗竭-H1299和A549細(xì)胞中過表達(dá)TIMP3，并觀察到TIMP3的異位表達(dá)減弱了KLF4或USP10敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞生長和遷移。一致地，異種移植測定表明TIMP3的過表達(dá)可以回補KLF4或USP10丟失的影響并抑制腫瘤發(fā)展。

研究結(jié)論：USP10和KLF4通過上調(diào)TIMP3來抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

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7.USP10的降低與KLF4和TIMP3的下調(diào)呈正相關(guān)，并預(yù)測肺癌患者的不良預(yù)后

????????為了評估USP10-KLF4-TIMP3軸的臨床重要性并確定它們在肺癌中的相關(guān)性，作者進(jìn)行了免疫組織化學(xué) (IHC) 染色以探究這些蛋白質(zhì)在肺ADC組織和鄰近組織的表達(dá)水平。IHC 結(jié)果顯示，與相鄰組織相比，USP10、KLF4和TIMP3的表達(dá)水平在肺ADC組織中顯著下調(diào)。特別是，USP10、KLF4或TIMP3水平相對較低的肺腫瘤患者的總生存期比這些蛋白質(zhì)水平高的患者短。此外，數(shù)據(jù)表明，這些腫瘤樣本表現(xiàn)出USP10、KLF4和TIMP3蛋白表達(dá)水平之間的正相關(guān)。通過分析從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫獲得的兩組肺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證實了上述發(fā)現(xiàn)。作者證實肺腫瘤組織中KLF4和TIMP3的 mRNA 水平低于正常組織，并且KLF4也與TIMP3表達(dá)水平呈正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP10的降低與KLF4和TIMP3的下調(diào)呈正相關(guān)，并預(yù)測肺癌患者的不良預(yù)后。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的研究為KLF4在肺癌中的調(diào)控機制提供了新的見解，并揭示了USP10是KLF4去多聚泛素化的新型DUB。功能研究表明, USP10表達(dá)的缺失促進(jìn)了體外和體內(nèi)肺腫瘤的發(fā)生。此外，這一研究進(jìn)一步證實了TIMP3是肺癌中KLF4的下游靶基因?？傊?，結(jié)果表明USP10是KLF4的重要調(diào)節(jié)因子，并且USP10-KLF4-TIMP3信號軸在肺癌抑制中起著關(guān)鍵作用。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41418-019-0458-7