標(biāo)題

我國原核微生物分類學(xué)七十年

作者

張玉琴，呂志堂，崔恒林，許學(xué)偉，阮志勇，李文均

摘要

2022年和2023年分別是中國微生物學(xué)會成立70周年和《微生物學(xué)報(bào)》創(chuàng)刊70周年，我國原核微生物分類學(xué)研究從白手起家、跟蹤模仿到逐步走上國際舞臺，從跟跑、并跑到整體處于國際先進(jìn)行列，部分領(lǐng)域領(lǐng)跑國際同行，并為國際同行提供微生物數(shù)據(jù)服務(wù)，也已走過了70個歲月。這些成績的取得是我國原核微生物分類領(lǐng)域?qū)W者幾代人努力的結(jié)果，是與國家發(fā)展、民族復(fù)興同頻共振的結(jié)果。特別是近30年，我國原核微生物分類無論從理論、方法創(chuàng)新還是新物種發(fā)現(xiàn)方面都取得了令人矚目的成績，在國際上的地位和影響力日益提高，已經(jīng)逐漸成為國際原核系統(tǒng)分類領(lǐng)域的主導(dǎo)力量。本文本著尊重歷史、客觀求實(shí)的態(tài)度梳理了70年來我國在細(xì)菌和古菌分類學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展脈絡(luò)和取得的成績，并結(jié)合該領(lǐng)域最新發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

原核微生物一般指無核膜包裹，只存在稱作核區(qū)(nuclear region or nuclear area)的裸露DNA，也沒有線粒體或任何其他膜結(jié)合的細(xì)胞器的原始單細(xì)胞生物，偶爾有原核微生物為多細(xì)胞生物。原核微生物在沒有配子融合的情況下繁殖，是地球上最早和最原始的生命形式。在三域系統(tǒng)中原核微生物包括細(xì)菌域和古菌域[1]。在過去的70年里，我國原核微生物分類學(xué)走過了國際微生物分類學(xué)發(fā)展的100年的歷程，從最基礎(chǔ)的以形態(tài)和生理生化特征分類為主，到20世紀(jì)80年代引入化學(xué)分類和數(shù)值分類方法，90年代中期起逐步建立以16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析為主線的多相分類體系，發(fā)展到現(xiàn)在以基因組水平為主要分類依據(jù)的研究體系。本文以我國原核微生物分類學(xué)技術(shù)的發(fā)展為線索，梳理了70年來我國學(xué)者在原核微生物分類學(xué)研究中取得的成績和對微生物學(xué)科的貢獻(xiàn)，以緬懷紀(jì)念前輩，激勵我們踔厲奮發(fā)，勇毅前行，以期為原核微生物分類學(xué)未來的發(fā)展提供借鑒。

1 ?形態(tài)和生理生化分類時代?(20世紀(jì)80年代以前)

1773年，Müller首先對微生物進(jìn)行分類，直到19世紀(jì)中后期原核微生物分類尚處于簡單的形態(tài)分類階段[2]。Cohn純培養(yǎng)技術(shù)的建立幫助人類開始認(rèn)識微生物的表型特征。1921年，Orla-Jensen把微生物的生理學(xué)特性正式納入細(xì)菌分類，由此形成了以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的微生物表型分類學(xué)的萌芽[3]。真正意義上的原核微生物分類學(xué)則始于1923年《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology)的發(fā)行。

20世紀(jì)80年代之前，我國原核微生物分類學(xué)研究工作主要集中在中國科學(xué)院微生物研究所開展。以形態(tài)學(xué)特征為主、生理生化特征為輔的分類研究手段，主要開展了細(xì)菌和放線菌的分類研究，成果主要發(fā)表在《科學(xué)通報(bào)》《微生物學(xué)報(bào)》和《微生物學(xué)通報(bào)》等學(xué)術(shù)期刊上。放線菌是原核微生物中形態(tài)特征最為豐富的類群，除細(xì)菌形態(tài)外，典型的放線菌具有基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的分化，部分放線菌的形態(tài)隨培養(yǎng)條件的變化呈現(xiàn)出不同的特征。放線菌的表型分類歷史代表著原核微生物表型分類體系的發(fā)展。

自從1943年Waksman等從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)鏈霉素等具有顯著醫(yī)療價值的抗生素，抗生素研究的熱潮推動了我國和全世界放線菌分類學(xué)的發(fā)展[4]。中國科學(xué)院微生物研究所閻遜初院士1950年創(chuàng)建了我國放線菌分類學(xué)學(xué)科[5-6]。1961年，從蘇聯(lián)學(xué)成歸來的阮繼生加入了放線菌研究隊(duì)伍，他在國內(nèi)首創(chuàng)性使用電子顯微鏡觀察放線菌孢子表面形態(tài)、“埋片法”觀察放線菌菌絲形態(tài)，在國際上首先發(fā)現(xiàn)孢子表面結(jié)構(gòu)可用于分類[7]。

《細(xì)菌和放線菌的鑒定》《細(xì)菌分類基礎(chǔ)》《鏈霉菌鑒定手冊》和《放線菌分類基礎(chǔ)》等譯著和著作是這個時期的代表作，引導(dǎo)著我國原核微生物分類學(xué)在之后半個世紀(jì)的發(fā)展[8-11]。其中，《鏈霉菌鑒定手冊》重點(diǎn)關(guān)注產(chǎn)生抗生素的鏈霉菌(Streptomyces)，將相關(guān)資料匯集在一起，提出以形態(tài)和培養(yǎng)特征為主，生理生化特性為輔的分類原則，將約800種鏈霉菌劃分為14個類群[12]。

表型分類學(xué)方法體系的建立和微生物資源應(yīng)用，為中國原核微生物學(xué)分類學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，并對微生物學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用產(chǎn)生了重要影響。

2 ?多相分類方法的建立時代?(20世紀(jì)80年代至90年代中期)

早在19世紀(jì)，分類學(xué)家就已經(jīng)認(rèn)識到分類不能依賴某一項(xiàng)指標(biāo)。1970年，美國Rita Colwell提出多相分類(polyphasic taxonomy)的概念，利用了一系列廣泛的來自表型和基因型的信息，將信息從分子特性延伸到生態(tài)特征，并將其用于描述所有分類水平上的分類單元，采用的技術(shù)包括化學(xué)分類、數(shù)值分類和分子分類等技術(shù)[12]?；瘜W(xué)分類法體現(xiàn)了薄層層析和高效液相色譜技術(shù)等化學(xué)研究手段在原核微生物分類學(xué)中的應(yīng)用，數(shù)值分類法是計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物化學(xué)和原核微生物分類學(xué)的結(jié)合，分子分類則是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和計(jì)算數(shù)學(xué)等多學(xué)科結(jié)合的產(chǎn)物，通過這些技術(shù)方法能獲得原核微生物關(guān)鍵的表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育信息。

Woese和Stackebrandt根據(jù)16S rRNA相似性、DNA-rRNA雜交和DNA-DNA雜交的結(jié)果，構(gòu)建了放線菌與其他微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，放線菌作為高(G+C)含量、革蘭氏陽性細(xì)菌的一個分支，與芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和梭菌屬(Clostridium)構(gòu)成的梭狀菌分支有著共同的起源，從此放線菌系統(tǒng)學(xué)進(jìn)入了分子分類時代[13]。菌株基因組(G+C)含量的測定、DNA-DNA (rRNA)分子雜交技術(shù)以及脈沖凝膠電泳技術(shù)在種屬水平上研究細(xì)菌、放線菌分類地位是一個強(qiáng)有力的手段，可以用來解決傳統(tǒng)分類方法難以解決的問題。DNA-DNA同源性可以揭示種間和種內(nèi)的親源關(guān)系，而DNA-rRNA雜交在屬的水平上則會發(fā)揮更大的作用[14-17]。同時期，基于微生物大量表型性狀相似度比較的數(shù)值分類研究方法也在細(xì)菌分類學(xué)研究中得到應(yīng)用。1983年Williams等利用數(shù)值分類對放線菌的鏈霉菌及相關(guān)菌進(jìn)行了大量的研究，為理清當(dāng)時鏈霉菌混亂的分類系統(tǒng)作出了貢獻(xiàn)[18]。

1990年，Woese等通過rRNA及RNA聚合酶(RNA polymerase)分子結(jié)構(gòu)特征和序列比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸分子的結(jié)構(gòu)和序列比表型更能揭示生命的進(jìn)化關(guān)系，將地球上的生命分為3個基本類群，正式建立了三域分類系統(tǒng)(the three-domain system)，并將生物分類的最高等級命名為域(domain)，生命三域分別為古菌域、細(xì)菌域和真核生物域，由此開啟了原核微生物系統(tǒng)學(xué)的研究序幕[19]。

20世紀(jì)80年代起，在中國科學(xué)院微生物研究所的支持和影響下，國內(nèi)從事原核微生物分類研究的隊(duì)伍迅速壯大，云南大學(xué)、河北大學(xué)、四川大學(xué)、遼寧大學(xué)、廣西農(nóng)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所、中國科學(xué)院林業(yè)土壤研究所(現(xiàn)為中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所)、山西省微生物所、四川抗生素研究所和福建省微生物所等逐步成為我國原核微生物分類的重要機(jī)構(gòu)，但絕大多數(shù)成果依然僅限于國內(nèi)刊物上發(fā)表。中科院微生物所閻遜初院士領(lǐng)導(dǎo)的放線菌分類研究組，除使用光學(xué)顯微鏡和生理生化實(shí)驗(yàn)等常規(guī)方法外，還使用電子顯微技術(shù)、超薄切片技術(shù)、全細(xì)胞和細(xì)胞壁的氨基酸和糖組分分析、DNA的(G+C)含量測定等化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，開展了大量的研究工作，建立了形態(tài)學(xué)和化學(xué)特征均區(qū)別于放線菌目中已有的60多個屬的3個新屬：小鏈孢菌屬(Microstreptospora)、類鏈霉菌屬(Streptomycoides)和異壁放線菌屬(Actinoallotaichus)。3個新屬級的放線菌分類單元的發(fā)現(xiàn)與建立，豐富了放線菌分類學(xué)的研究內(nèi)容[20-22]。這3個新屬先后在《微生物學(xué)報(bào)》上發(fā)表后，引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。阮繼生通過化學(xué)分類研究，發(fā)現(xiàn)原定種名為東方諾卡氏菌(Nocardia orientalis)等8個典型菌株的菌體內(nèi)沒有枝菌酸，而諾卡氏菌屬應(yīng)該含有枝菌酸，據(jù)此建立了無枝菌酸屬(Amycolata)和擬無枝菌酸屬(Amycolatopsis)兩個新屬，與美、德兩國科學(xué)家聯(lián)名發(fā)表。這是國內(nèi)科學(xué)家參與并有單位屬名，且發(fā)表在國際公認(rèn)的權(quán)威分類學(xué)期刊——國際細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)雜志(Int. J. Syst. Bacteriol, IJSB)上的最早記錄[23]。阮繼生、劉志恒、張利平等將細(xì)胞壁、磷酸類脂、甲基萘醌和枝菌酸等細(xì)胞化學(xué)組分分析用于諾卡氏菌形放線菌等類群放線菌的分類之中，使分類學(xué)的內(nèi)容從表觀水平深入到細(xì)胞水平[24-28]。這些方法的建立及應(yīng)用，代表了我國原核微生物化學(xué)分類時期。1987年，四川抗生素研究所胡潤茂等在IJSB上發(fā)表了完全由中國學(xué)者在國內(nèi)進(jìn)行研究，并第一個得到國際承認(rèn)的放線菌新種天藍(lán)色糖單孢菌(Saccharomonospora azurea)[29]；次年，他們又發(fā)表了深藍(lán)色糖單孢菌(Saccharomonospora cyanea)新種[30]。

1980年代末至1990年代初期，中國科學(xué)院微生物研究所的放線菌分類組重點(diǎn)攻克了RNA和DNA序列分析技術(shù)，建立了將形態(tài)、化學(xué)分類指征及分子分類技術(shù)相結(jié)合的放線菌分類研究體系，對云南地區(qū)不同環(huán)境下的諾卡氏菌形放線菌、游動放線菌、馬杜拉放線菌、嗜鹽堿放線菌及共生固氮弗蘭克氏菌進(jìn)行了分類研究。放線菌研究在這個階段成果顯著：(1)?完成了弗蘭克氏菌DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)，獲得了弗蘭克氏菌新基因種[31]、擬諾卡氏菌屬及無枝酸菌屬及其相關(guān)菌株的限制性酶切片段長度多態(tài)型性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)數(shù)據(jù)[32]；(2)?掌握了23S rRNA序列分析技術(shù)，并依據(jù)23S rRNA 5′末端序列區(qū)分析鏈霉菌屬、小單孢菌屬、無枝酸菌屬及糖單孢菌屬不同屬的種。這種用形態(tài)、化學(xué)分類指征與23S rRNA序列分析相結(jié)合分屬種的做法，當(dāng)時在國內(nèi)微生物分類學(xué)中尚屬首次報(bào)道[33-34]；(3)?依據(jù)16S?23S rRNA間隔區(qū)大小與序列區(qū)分“種”，發(fā)現(xiàn)了伊拉克放線多孢菌(Actinopolyspora iraqiensis)[35]與嗜鹽擬諾卡氏菌(Nocardiopsis halophila)[36]兩個新種。這些新種均被收錄入《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第二版中；(4)?用16S?23S rRNA間隔區(qū)鑒定弗蘭克氏菌，為國際弗蘭克氏菌定種難題的解決提供了新思路[37]。20世紀(jì)80年代中期，北京農(nóng)業(yè)大學(xué)(現(xiàn)中國農(nóng)業(yè)大學(xué))陳文新院士在國內(nèi)率先開展了根瘤菌分類研究，1988年，該課題組通過對快生大豆根瘤菌進(jìn)行數(shù)值分類建立了中華根瘤菌屬(Sinorhizobium?gen. nov.)，將原費(fèi)氏根瘤菌(Rhizobium fredii)再分類為費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)，并描述了新疆中華根瘤菌新種(Sinorhizobium?xinjiangensis?sp. nov.)[38]；1995年，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析證據(jù)將椰毒假單胞菌(Pseudomonas cocovenenans)轉(zhuǎn)入伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)，作為椰毒伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cocovenenans)新組合[39]。

甘油二醚是區(qū)分細(xì)菌和古菌的重要化學(xué)分類指標(biāo)。正是依據(jù)這一古菌特有的細(xì)胞膜脂組分，我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)先期分離鑒定的嗜熱嗜酸硫球菌(Sulfosphaerellus thermoacidphilum)擁有古菌的特征[40-41]。同樣是根據(jù)這一重要指標(biāo)，王大珍描述了大柴旦鹽桿菌(Halobacterium dachaidanensis)和塘沽鹽桿菌(Halobacterium tangguensis) 2個嗜鹽古菌新種[42]，周培瑾描述了產(chǎn)堿嗜鹽桿菌(Halobacterium haloalcaligenum)等古菌新種[43]。這些研究成果開創(chuàng)了我國學(xué)者研究古菌的先河，為我國后續(xù)開展古菌分類學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1990年阮繼生、劉志恒、梁麗糯、楊德成主編的《放線菌研究及應(yīng)用》出版。1992年 ?? 閻遜初編著的《放線菌的分類與鑒定》出版。1995年，姜成林、徐麗華與許宗雄合著的《放線菌分類學(xué)》出版發(fā)行。其中，《放線菌的分類與鑒定》是當(dāng)時國內(nèi)外有關(guān)放線菌分類研究成果的總結(jié)性專著，書中對當(dāng)時發(fā)表的60多屬和近2 000種進(jìn)行了歸納整理和分類描述[44]?！度樗峋飳W(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用》[45]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[46]較全面介紹乳酸細(xì)菌分類、生理、生態(tài)、遺傳和應(yīng)用，對當(dāng)時最新建立的新屬、新種進(jìn)行了描述。

在此期間，陳文新等先后于1991年、1995年發(fā)表了關(guān)于華癸根瘤菌(Rhizobium huakuii)和天山根瘤菌(Rhizobium tianshanense)新物種的研究結(jié)果(表1)。

這一時期，隨著研究水平提升，我國學(xué)者開始在國際機(jī)構(gòu)中有了任職。例如，中國科學(xué)院微生物研究所宋大康在20世紀(jì)80–90年代擔(dān)任世界微生物菌種保藏聯(lián)盟執(zhí)行理事、聯(lián)合國教科文組織和聯(lián)合國環(huán)境署全球微生物資源中心網(wǎng)絡(luò)北京中心主任、聯(lián)合國教科文組織東南亞地區(qū)微生物和生物技術(shù)網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)委員；宋大康、閻遜初、阮繼生等學(xué)者在1980年代開始在國際相關(guān)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)任職(表2)，極大地促進(jìn)了我國微生物分類學(xué)的國際合作。

3 ?多相分類發(fā)展時期(20世紀(jì)90年代中期至今)

3.1 ?全面與國際接軌階段

20世紀(jì)90年代后期，我國原核微生物分類各個領(lǐng)域開始與國際接軌采用多相分類技術(shù)手段，并注重將研究成果在國際權(quán)威刊物上發(fā)表。這一時期，分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，提高了原核微生物學(xué)分類學(xué)的研究水平。1991年，云南大學(xué)姜成林等在IJSB上發(fā)表了完全由中國學(xué)者在國內(nèi)進(jìn)行的研究，并第一個合格化發(fā)表的放線菌新屬——雙孢放線菌屬(Actinobispora)[47]。1993年四川抗生素工業(yè)研究所的胡潤茂等發(fā)表了放線菌新屬——游動四孢菌屬(Planotetraspora)[48]。1998年，周志紅和劉志恒等發(fā)表棘孢絲糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosporotrichia)新種[49 ]；1999年，姜成林等先后發(fā)表了雙孢放線菌屬(Actinobispora) 3個新種、糖單孢菌屬(Saccharomonospora) 1個新種以及鏈霉菌屬(Streptomyces) 1個新種相關(guān)文章[50]；1997年，陳文新院士等發(fā)表海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)新種及天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)與相關(guān)根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳關(guān)系研究成果[51]。1999年中科院微生物所周培瑾課題組基于分離自西藏班戈湖的菌株A33和GA33建立了鹽堿紅菌屬(Natronorubrum)并描述了班戈鹽堿紅菌(Natronorubrum bangense)和西藏鹽堿紅菌(Natronorubrum tibetense)[52]，這是我國研究者首次在國際微生物分類學(xué)權(quán)威期刊上發(fā)表嗜鹽古菌新分類單元。2000年，該團(tuán)隊(duì)又描述了來自艾丁湖的古菌新種——多形鈉線菌(Natrinema versiforme)和來自南極樣品的一個嗜冷細(xì)菌新種——南極微球菌(Micrococcus antarcticus)[53]。上述研究成果均發(fā)表在國際原核微生物分類權(quán)威期刊IJSB上。至此，我國放線菌、細(xì)菌和古菌分類全部登上國際舞臺(表1)。該時期，阮繼生和陳文新院士于1996年受邀擔(dān)任國際細(xì)菌分類學(xué)委會委員。

3.2 ?迅速發(fā)展、迎頭趕上、跨越趕超階段

進(jìn)入新千年2000年，International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB)更名為International Journal of Systematic and?Evolutionary Microbiology (IJSEM)。我國原 ?核微生物分類學(xué)研究迎來了百花齊放的時代，專業(yè)人才隊(duì)伍力量日漸強(qiáng)大，技術(shù)、方法推陳出新。

隨著我國國力日趨強(qiáng)大，微生物分類學(xué)研究受到重視，國家層面的一系列相關(guān)舉措和國家發(fā)展的需求牽引，進(jìn)一步助推微生物分類學(xué)的發(fā)展，我國原核微生物分類學(xué)贏得了千載難逢的發(fā)展機(jī)遇。這一時期我國在分類方法方面與國際同行差距迅速縮小，由跟跑到并跑，并在新物種發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域逐漸領(lǐng)先全球，發(fā)現(xiàn)的原核微生物、尤其是放線菌和古菌新分類單元的數(shù)量迅速增加。2003年，我國機(jī)構(gòu)在IJSEM上發(fā)表論文17篇，排名全球第六，一年在IJSEM發(fā)表的論文數(shù)量僅比2000年及以前在IJSB及IJSEM發(fā)表的論文數(shù)量總和少1篇；2003?2012年10年間，在國際公認(rèn)的分類學(xué)最權(quán)威期刊IJSEM雜志上發(fā)表的放線菌新物種256個，占全世界發(fā)表新物種數(shù)量的1/4強(qiáng)。從2009年我國機(jī)構(gòu)在IJSEM上年發(fā)表的論文數(shù)量首次達(dá)到全球各國第一位起，此頂桂冠從未旁落。根據(jù)LPSN統(tǒng)計(jì)，2010–2022年間，我國學(xué)者合格化發(fā)表的新分類單元數(shù)量穩(wěn)居世界第一(圖1)，我國在原核微生物分類上的整體優(yōu)勢明顯。截至2022年底，我國學(xué)者先后描述了199個古菌新種，占現(xiàn)有古菌物種(640個種)的31% (LPSN, https://lpsn.dsmz.de)。在此期間，以李文均、杜宗軍、崔恒林、許學(xué)偉等為代表的一代具有較強(qiáng)國際影響的中青年微生物分類學(xué)家迅速成長起來，并在國際學(xué)術(shù)組織、國際學(xué)術(shù)期刊中擔(dān)任職務(wù)(表3)，李文均和老一輩放線菌分類學(xué)家阮繼生、劉志恒先后斬獲國際原核微生物分類學(xué)領(lǐng)域的斯克爾曼獎和伯杰氏獎?wù)?表4)。由于在微生物分類學(xué)研究的成就，陳文新、陶天申、劉志恒、黃英、陳文峰和李文均、崔曉龍、唐蜀昆、職曉陽等受邀請參加撰寫《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(第二版)中的相關(guān)章節(jié)。

4 ?項(xiàng)目和平臺建設(shè)

從上述歷史可以看出近30年是我國原核微生物分類走上國際舞臺、迅速發(fā)展的關(guān)鍵時期，其中，這和國家在項(xiàng)目和平臺建設(shè)方面給予該學(xué)科的大力扶持和支持是密不可分的。

4.1 ?項(xiàng)目驅(qū)動的學(xué)科發(fā)展和分類學(xué)人才培養(yǎng)

20世紀(jì)80年代中后期，多個科研院所和高校開展了多種環(huán)境下特色微生物資源研究，助力推進(jìn)了原核微生物分類學(xué)的發(fā)展。1990年4月論證通過的國家自然科學(xué)基金委微生物學(xué)科第一個重大項(xiàng)目——“云南放線菌生態(tài)分布及其資源前期開發(fā)”，則是我國對一個省的微生物資源進(jìn)行大規(guī)模研究與開發(fā)的第一個，也是迄今為止唯一的重大計(jì)劃，是我國放線菌資源研究歷史上的一個重要里程碑。云南大學(xué)的姜成林、徐麗華等分別開展了嗜熱、嗜酸、嗜冷和嗜鹽堿等極端環(huán)境放線菌分類學(xué)研究；河北大學(xué)的宋尚直、張利平等分別開展的嗜鹽堿放線菌、弗蘭克氏菌以及鏈孢囊放線菌分類研究；四川抗生素研究所胡潤茂等開展了糖單孢菌、游動放線菌等稀有放線菌的分類研究；福建微生物研究所程元榮等開展了小單孢菌資源及分類研究；中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所在弗蘭克氏菌的多樣性及分類研究方面均取得較好的進(jìn)展。在老一輩分類學(xué)家的培養(yǎng)下，經(jīng)過多年的積累沉淀，2000年之后，我國原核微生物分類人才迅速成長，以李文均、許學(xué)偉等為代表的一代中青年原核微生物分類學(xué)者逐步走上國際舞臺，相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)在3.2節(jié)論述，并將在本文第5、6節(jié)結(jié)合各團(tuán)隊(duì)工作進(jìn)一步論述。

4.2 ?國家菌種資源庫(國家微生物資源平臺)的建設(shè)與運(yùn)行

根據(jù)《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》和《國家科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)綱要(2004–2010)》，國家科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)于2003年全面啟動。國家微生物資源平臺建設(shè)工作分別以中國農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥用、工業(yè)、獸醫(yī)、普通、林業(yè)、典型培養(yǎng)物和海洋9個國家專業(yè)微生物菌種管理保藏中心為核心單位，覆蓋全國24個省市，在不同領(lǐng)域內(nèi)組織資源優(yōu)勢單位 ?103家進(jìn)行資源的標(biāo)準(zhǔn)制定，開展微生物資源的整理整合。國家微生物資源平臺于2011年11月由科技部、財(cái)政部認(rèn)定通過，是首批認(rèn)定的 ???23個國家科技基礎(chǔ)條件平臺之一，成為保證國家微生物資源庫藏安全的重要載體。2019年，科技部、財(cái)政部正式發(fā)布科技資源共享服務(wù)平臺優(yōu)化調(diào)整名單，國家微生物資源平臺優(yōu)化調(diào)整為國家菌種資源庫(National Microbial Resource Center, NMRC)。

國家微生物資源共享服務(wù)平臺以9個國家級菌種保藏管理中心為核心，通過平臺門戶網(wǎng)站(http://www.nimr.org.cn/)以及9個國家級菌保中心各自的門戶網(wǎng)站開展對外共享服務(wù)(表5)。截至2019年底，平臺庫藏資源總量達(dá)259 333株，備份350余萬份，分屬于2 484屬，13 373種。其中對外可共享量達(dá)160 200株，占國內(nèi)可共享菌種總量的80%以上。

2009–2022年期間，以國家微生物資源共享服務(wù)平臺的運(yùn)行服務(wù)為核心，先后在北京、大慶、蘭州等地舉辦了13屆學(xué)術(shù)研討會，為我國從事原核微生物分類研究工作者提供了專業(yè)學(xué)術(shù)交流平臺，推動了原核微生物分類研究工作的進(jìn)程。

4.3 ?WDCM落戶北京及WDCM發(fā)起的GCM2.0萬種模式微生物基因組測序計(jì)劃

隨著我國微生物分類學(xué)國際影響力日益擴(kuò)大，2010年，世界微生物數(shù)據(jù)中心(World Microbial Data Center, WDCM)落戶中國科學(xué)院微生物研究所，這是我國生命科學(xué)領(lǐng)域的第一個世界數(shù)據(jù)中心。世界微生物數(shù)據(jù)中心由世界菌種保藏聯(lián)盟在20世紀(jì)60年代建立，是全球微生物領(lǐng)域最重要的實(shí)物資源數(shù)據(jù)平臺。中國第一次作為世界微生物數(shù)據(jù)中心的主持單位，引領(lǐng)世界微生物資源的信息化發(fā)展，是國際社會對我國的充分信任。現(xiàn)代生物科技的迅速發(fā)展使微生物及其基因資源數(shù)據(jù)正呈現(xiàn)爆炸性增長。海量數(shù)據(jù)的整理整合和開放共享對于微生物資源的研究和利用至關(guān)重要。

中科院微生物研究所以WDCM為平臺，通過倡導(dǎo)全球微生物菌種保藏目錄(Global?Catalogue of?Microorganisms, GCM)旨在為分散于全球各個保藏中心和科學(xué)家手中寶貴的微生物資源提供一個全球統(tǒng)一的數(shù)據(jù)倉庫，并以統(tǒng)一數(shù)據(jù)門戶的形式，對全世界科技界和產(chǎn)業(yè)界提供微生物菌種資源的信息服務(wù)。目前已經(jīng)有來自美國、法國、德國和荷蘭等50個國家和地區(qū)的133個微生物資源保藏機(jī)構(gòu)正式參加這一計(jì)劃。

2017年，WDCM和中國科學(xué)院微生物研究所牽頭，并聯(lián)合12個國家的微生物資源保藏中心發(fā)起GCM2.0項(xiàng)目，計(jì)劃建立覆蓋超過20個國家的30個主要保藏中心的微生物資源基因組測序和功能挖掘合作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)計(jì)完成超過 ??10 000株的微生物模式菌株基因組測序。

2019年3月5日，WDCM與《國際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)雜志》(IJSEM)和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)的管理機(jī)構(gòu)伯杰氏手冊基金會(Bergey’s Manual Trust)在中國科學(xué)院微生物研究所正式簽署合作協(xié)議。WDCM將在全球微生物模式菌株基因組測序計(jì)劃(GCM2.0)的框架內(nèi)與IJSEM和伯杰氏手冊基金會開展密切合作。

在實(shí)現(xiàn)國家各項(xiàng)規(guī)劃項(xiàng)目中，原核微生物分類學(xué)方法體系得以完善，研究成果斐然。除了普通細(xì)菌和放線菌之外，長期以來，粘細(xì)菌的研究受限于菌株的純化和培養(yǎng)。21世紀(jì)以來，山東大學(xué)李越中課題組經(jīng)過不懈努力，建立起了我國目前最大的粘細(xì)菌資源菌庫，創(chuàng)立粘細(xì)菌研究的基礎(chǔ)和技術(shù)平臺，對粘細(xì)菌資源進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

5 ?分類體系和方法研究

微生物分類學(xué)研究的終極目標(biāo)是建立一個反映微生物進(jìn)化的自然分類系統(tǒng)，而科學(xué)合理的分類方法是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要保障。我國原核微生物分類工作者在始終不忘初心，在向著這一目標(biāo)努力。

5.1 ?六界系統(tǒng)的提出

早在以經(jīng)典的形態(tài)和生理生化特征為主的學(xué)習(xí)模仿階段，著名的細(xì)菌分類學(xué)家王大耜先生就在1977年出版的《細(xì)菌分類基礎(chǔ)》中在魏特克五界系統(tǒng)之下增加了病毒界，建立了六界系統(tǒng)，這一觀點(diǎn)曾廣泛傳播，為眾多研究者所接受，并寫入多部高?！段⑸飳W(xué)》教材之中[6]。

5.2 ?分類研究方法的整理與系統(tǒng)化

2001年，東秀珠等在《一般細(xì)菌常用鑒定方法》(1978)一書的基礎(chǔ)上編寫的《常見細(xì)菌鑒定手冊》匯集了細(xì)菌分類研究的基本方法。2007年，徐麗華、李文均、劉志恒、姜成林等組織國內(nèi)的相關(guān)同行出版了《放線菌系統(tǒng)學(xué)——原理、方法及實(shí)踐》一書，根據(jù)作者和國際同行的最新研究成果，以分子系統(tǒng)學(xué)為重點(diǎn)，全面論述現(xiàn)代放線菌系統(tǒng)分類學(xué)的發(fā)展簡史、基本原理、分類系統(tǒng)，介紹目、科、屬和每個屬有效發(fā)表的種及其原始文獻(xiàn)；并根據(jù)作者長期從事放線菌分類研究和教學(xué)所取得的新進(jìn)展和新經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合我國的國情，詳細(xì)論述放線菌分類程序和實(shí)驗(yàn)方法。另外，他們還對放線菌分類學(xué)存在的問題及值得研究的問題進(jìn)行了探討。2011年，由中國科學(xué)院微生物研究所阮繼生、黃英作為主編出版的《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》一書，對稀有放線菌進(jìn)行屬的識別，DNA探針快速鑒定屬，放線菌分類研究入門與DNA多位點(diǎn)序列、極端放線菌、植物內(nèi)生放線菌與海洋放線菌資源的分布與分離進(jìn)行了介紹，對目前國際放線菌系統(tǒng)分類的新成果，科、屬、種均有詳細(xì)介紹。

5.3 ?分類方法與技術(shù)創(chuàng)新

20世紀(jì)90年代末，依據(jù)16S rRNA序列分析重新定義了原核微生物分類系統(tǒng)。據(jù)此，在2001–2012年間出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)第二版中，原核微生物分類從傳統(tǒng)的基于表型的分類過渡到基于16S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析的多相分類學(xué)框架。但是，由于16S rRNA基因的高序列保守性，多相分類進(jìn)行屬級以上分類單元的層級分類中發(fā)揮著重要的指示性作用，而種和亞種水平的劃分常常指示性不足。

全基因組包含了生物全部的遺傳信息，其內(nèi)涵遠(yuǎn)遠(yuǎn)豐富于16S rRNA序列，所以分析全基因組數(shù)據(jù)能夠更加準(zhǔn)確與細(xì)致地研究物種的演化與分類。2003年，郝柏林院士所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)，提出了基于全基因組的親緣關(guān)系與分類研究方法——組分矢量構(gòu)樹法(CVTree)，目前已更新至CVTree3[54]。2001年，我國獨(dú)立完成了第一個古菌騰沖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因組序列測定，標(biāo)志著古菌資源發(fā)掘與分類學(xué)研究進(jìn)入了快車道。

2008年，黃英課題組率先將多基因位點(diǎn)序列分析法(multilocus sequence analysis, MLSA)成功用于鏈霉菌屬灰色鏈霉菌進(jìn)化分支的分類，將6個編碼蛋白質(zhì)的管家基因(atpD，gyrB，recA，rpoB，trpB和16S rRNA)串聯(lián)用于鏈霉菌屬的分類學(xué)研究，進(jìn)一步完善了鏈霉菌屬的系統(tǒng)分類研究體系，避免單獨(dú)使用16S rRNA基因反映細(xì)菌菌株間的親緣關(guān)系可能會導(dǎo)致的偏差和誤導(dǎo)[55]；云南大學(xué)唐蜀昆等又先后發(fā)展了細(xì)胞壁氨基酸、糖組分定量分析方法、細(xì)胞膜復(fù)雜醌組分的定量檢測APPI-LC-MS新方法，使得多相分類中化學(xué)特征的描述進(jìn)入精確定量時代[56-57]。

5.4 ?放線菌綱分類系統(tǒng)的建立和更新修訂

放線菌是革蘭氏陽性、高(G+C)的細(xì)菌，因其產(chǎn)抗生素及廣泛的生物活性一直受到人們的注重，放線菌也一直是國際原核微生物分類領(lǐng)域研究最活躍的類群之一，其分類系統(tǒng)也不斷被修改與完善。2009年，職曉陽等根據(jù)2 600多條放線菌16S rRNA基因序列特征性核苷酸數(shù)據(jù)，通過全面的系統(tǒng)發(fā)育分析(包括基因組多基因序列分析)，提出了放線菌綱(Actinobactria)各高級分類單元系統(tǒng)進(jìn)化的新思路，并對各高級分類單元進(jìn)行了較為全面的描述；對一些尚未能明確分類地位或者經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)有問題的類群進(jìn)行了重新定位和修訂，建議了2個新亞目、4個新科[58]。該研究論文累計(jì)被引已達(dá)620次，連續(xù)多年位居WOS高被引論文，研究成果被《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第二版第5卷——放線菌卷作為分類路線圖所采用。

隨著微生物基因組測序的普及化，以基因組信息為主要判定指標(biāo)的原核微生物分類學(xué)提速發(fā)展，微生物分類已經(jīng)進(jìn)入了組學(xué)時代。自2018年1月開始，IJSEM要求新種的發(fā)布需要提供基因組測序數(shù)據(jù)。這一規(guī)則下，以16S rRNA基因序列為提示、結(jié)合全基因組核苷酸一致性比較以及發(fā)育分析為區(qū)分原核微生物物種依據(jù)的多相分類流程已成為公認(rèn)的原核微生物分類研究程序。在此背景下，2020年，李文均教授團(tuán)隊(duì)根據(jù)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育基因組分析結(jié)果對放線菌門高等級分類進(jìn)行了更新，將放線菌門425個合格化描述的屬分為6個綱。46個目和79個科，其中包括16個新目和10個新科，并將放線菌綱的拉丁文由原來的Actinobacteria修訂為合乎ICNP 2019 Rule 8命名法規(guī)的Actinomycetia，模式屬為放線菌屬(Actinomyces)[59]。

6 ?原核微生物分類面臨的新問題與機(jī)遇

6.1 ?未培養(yǎng)微生物分類

借助單擴(kuò)增基因組(single amplification of the genome, SAGs)和宏基因組組裝基因組(metagenomic assembly genome, MAGs)技術(shù)，未培養(yǎng)微生物分類學(xué)已經(jīng)成為國際上新的研究熱點(diǎn)，未培養(yǎng)古菌和細(xì)菌發(fā)現(xiàn)數(shù)量激增。我國學(xué)者在相關(guān)領(lǐng)域也取得了令人矚目的成績，李猛課題組拓展了人們對Asgard古菌的認(rèn)知，描述了6個

門，包括較為原始的悟空古菌門(Ca.?Wukongarchaeota)[49]；肖湘和王鳳平團(tuán)隊(duì)先后建立了哪吒古菌門(Ca.?Nezhaarchaeota)和女媧古菌目(Ca.?Nuwarchaeales)[50-51]；李文均團(tuán)隊(duì)建立了屬于納米嗜鹽古菌門(Ca.?Nanohaloarchaeota的一個新目Ca.?Nucleotidisoterales[52]；向華課題組建立了Ca.?Nanoanaerosalinaceae和Ca.?Nanohalalkaliarchaeaceae[53]，這是我國學(xué)者在免培養(yǎng)古菌分類學(xué)研究領(lǐng)域的重大突破。

2015年在線公布的2008年修訂版《國際原核微生物命名法規(guī)》(ICNP)綜合考慮近年未培養(yǎng)微生物研究的巨大進(jìn)展，增列了附錄11暫定狀態(tài)(Appendix11.The Provisional Status Candidatus)，并于2019年1月以?？问匠霭妗５?，很多科學(xué)家認(rèn)為由于ICNP只承認(rèn)培養(yǎng)物為“模式材料”(type material)，從而阻止了未培養(yǎng)微生物的命名。

6.2 ?關(guān)于門等級命名法規(guī)的執(zhí)行及其導(dǎo)向

2015年，國際原核微生物系統(tǒng)學(xué)委員會(International Committee on Systematics of Prokaryotes,?ICSP)在官方期刊IJSEM上發(fā)表論文，提議將“門”納入原核微生物的命名法規(guī)中，并建立一個新系統(tǒng)。幾經(jīng)修改，2021年2月，改名問題被提交給委員會投票，最終以19:2獲得通過。2021年2月，ICSP投票決定在將來的ICNP中對rules 5b、8、15和22進(jìn)行修訂，加入門等級的命名規(guī)則，并正式在IJSEM上合格化了42個基于屬模式的門的名稱及正式描述[60]。這是原核生物改名的重大嘗試，這一變化正標(biāo)志著科學(xué)家們對微生物的理解不斷進(jìn)步。經(jīng)過梳理不難發(fā)現(xiàn)，這次命名規(guī)則的變化和42個門名稱的正式確立實(shí)際上是順應(yīng)基因組分類潮流的必然結(jié)果，傳統(tǒng)的微生物分類標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)過時，原核微生物分類學(xué)的未來道路漫漫。

7 ?展望

回顧原核微生物分類學(xué)研究發(fā)展歷史，在國際微生物分類發(fā)展的大事件中，我國從1980年代之前的跟跑到2000年以后的并跑乃至領(lǐng)跑，我國微生物學(xué)家們在分類學(xué)方面取得了很多突破性進(jìn)展，為我國的微生物學(xué)科建立了良好的基礎(chǔ)。他們在該領(lǐng)域內(nèi)開展了大量的研究，提出了許多新的分類學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了大量新物種，并為原核微生物學(xué)研究和應(yīng)用發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。

上述成績的取得得益于在2000年之后的十余年里，原核微生物分類學(xué)一直是國家自然科學(xué)基金的優(yōu)先資助領(lǐng)域。但是，隨著原核微生物分類學(xué)逐漸被排除出國家自然科學(xué)基金的優(yōu)先資助領(lǐng)域，以及國內(nèi)科研評價體系給分類學(xué)工作者帶來的巨大壓力，純粹的分類學(xué)研究已經(jīng)沒有生存空間。這是一個機(jī)遇與風(fēng)險并存的時代，原核微生物分類學(xué)要想贏得發(fā)展空間，必須與資源、生態(tài)、醫(yī)藥等國家戰(zhàn)略發(fā)展需求相結(jié)合。高通量測序、高性能計(jì)算等生物信息技術(shù)的快速發(fā)展使基因組測序成為可培養(yǎng)和未培養(yǎng)原核微生物分類學(xué)框架的基礎(chǔ)，組學(xué)時代及后組學(xué)時代多組學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于原核微生物分類學(xué)研究。如果能將這些新技術(shù)廣泛應(yīng)用，并將分類學(xué)研究與國家重大需求的緊密結(jié)合，把握好機(jī)會，我國原核微生物分類學(xué)研究必將二次騰飛，取得更大成績。