RNAm6A修飾問題匯總（第一期）
RNA m6A修飾無疑是表觀轉錄組學中最受關注的研究內(nèi)容之一，目前的研究已經(jīng)表明，m6A可能影響mRNA的運輸、降解、翻譯以及代謝等方方面面，這種轉錄后修飾參與多種病理生理過程。mRNA m6A研究該注意哪些問題？高通量測序獲得的差異甲基化分子該如何挑選？下游分子實驗該如何設計？紐科生物長期關注并參與RNA m6A修飾的課題，我們精心篩選并整理了有關m6A研究的常見問題，結合近期發(fā)表的m6A文獻綜述，給各位老師提供全面答疑。
參考文章封面：
文章鏈接：m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential
mRNA m6A修飾的位點序列、分布特征：
1）什么樣的序列會發(fā)生m6A修飾（序列偏好性）？m6A甲基化修飾主要受METT3/METTL14酶調(diào)控，修飾特征序列為DRACH（D:A\G\U，R=A\G，H=A\C\U），但是注意，并不是所有符合該序列規(guī)則的序列都能被甲基化，僅有小部分含有DRACH motif序列的片段能發(fā)生m6A修飾。目前文章中通常使用motif分析（圖1）進行序列富集的結果展示。
圖1：m6A Motif（https://www.nature.com/articles/cr201715/figures/1）
2）m6A修飾通常發(fā)生在什么區(qū)域，UTR還是CDS區(qū)（區(qū)域偏好性）？研究顯示m6A目前主要發(fā)生在終止密碼子附近和基因內(nèi)部較長的外顯子中（圖2），根據(jù)數(shù)據(jù)表明，基因內(nèi)部外顯子中長度超過200nt的個數(shù)占所有內(nèi)部外顯子個數(shù)的15%，但是這些外顯子中有近80%有m6A修飾位點，出現(xiàn)這個現(xiàn)象的原因并不是因為這些較長的內(nèi)部外顯子存在大量的motif，事實上這些外顯子只含有30%左右的motif序列。臨近可變多聚腺苷酸化（APA）m6A事件要多于遠端APA位點。METTL3/METTL14調(diào)控的m6A修飾系統(tǒng)并不僅僅受限于DRACH序列，還有更復雜的調(diào)控機制共同決定m6A修飾的發(fā)生位置。
圖2：m6A區(qū)域偏好性（https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105977）
3）什么因素決定m6A的位置選擇（調(diào)控過程）？內(nèi)部、外部因素共同決定調(diào)控m6A修飾位點選擇與過程，m6A調(diào)控蛋白（Writer, Eraser和Reader）和靶基因作為一個系統(tǒng)，內(nèi)部和外部是針對該系統(tǒng)進行定義，實際上m6A如何發(fā)生以及怎樣發(fā)生通常是受很多因素共同調(diào)控的，內(nèi)部因素包括特定序列與METTL3/METTl14的結合偏好性，外部因素主要依賴于轉錄因子，RNA結合蛋白（例如TARBP2），RNA聚合酶，H3K36me3組蛋白修飾可以募集METTL3/METTL14到mRNA并催化發(fā)生m6A修飾，當然FTO和ALKBH5也能在METTL3/METTL14之后在對m6A修飾水平進行改變。但是在這樣一個復雜的系統(tǒng)中，多種因素如何共同決定m6A位點選擇的疑問仍然沒有被完全解答。
圖3：m6A修飾的調(diào)控系統(tǒng)
（https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105977）
4）既然有內(nèi)外部因素共同決定，哪個占主導？如果外部因素占主導，那么理論上m6A修飾會成為一個高度動態(tài)的過程，細胞狀態(tài)改變，多種外部調(diào)控因素也會改變，m6A水平理應對不同狀態(tài)下包括RBP在內(nèi)的這些外部因素會有動態(tài)應答；如果內(nèi)部因素占主導，那么甲基化酶的改變會影響整體m6A的修飾，但不同位點m6A水平變化是相對有限的；也有可能內(nèi)、外部調(diào)控機制交織在一起，共同調(diào)控m6A修飾的位置、區(qū)域和水平，該問題還需要進一步研究。
5）除了m6A本身變化以外，有其他重要因素影響m6A調(diào)控嗎？有，那就是RNA m6A閱讀蛋白，也就是通常說的Reader蛋白，Reader蛋白也會競爭性的結合m6A位點，且Reader蛋白本身的結合水平和表達水平都會對m6A修飾基因產(chǎn)生影響，這就是為什么有時我們看到當m6A水平并沒有發(fā)生改變時，不同比例、水平的Reader蛋白也會造成被修飾基因發(fā)生改變的主要原因，當然發(fā)生在Reader蛋白上的翻譯后修飾也能對Reader蛋白自身的酶活、細胞定位以及結合親和性產(chǎn)生影響，所有這些綜合起來共同對mRNA m6A進行調(diào)控（圖4）。
圖4：YTH家族蛋白參與mRNA的代謝、翻譯和降解（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33928028/#&gid=article-figures&pid=figure-1-uid-0）
6）m6A修飾的特異性的作用：這種修飾特異性帶來的最直接影響是m6A介導的基因選擇性表達，一旦m6A集中在特定部分轉錄本群體時，m6A 閱讀蛋白的調(diào)控系統(tǒng)就會發(fā)揮重要功能。在研究示例中，小鼠胚胎干細胞mESCs中80%能調(diào)控多能性的基因都受到m6A修飾，這種修飾促進這些轉錄本的清除，從而讓細胞狀態(tài)由多能性轉向胚胎干細胞分化。不同位置的m6A修飾也有可能影響表達，m6A介導的調(diào)控效果依據(jù)位置的不同而不同。
圖5：Mettl3 KO ESCs resist termination of na?ve pluripotency
（m6A mRNA methylation facilitates resolution of na?ve pluripotency toward differentiation）
7）m6A mRNA的作用是什么？m6A修飾影響mRNA的降解和翻譯是目前主要觀點。YTHDF家族蛋白（包括YTHDF1、YTHDF、YTHDF）在內(nèi)的m6A閱讀蛋白調(diào)控m6A靶分子降解和翻譯。最早研究的YTHDF2可以通過多種途徑造成m6A mRNA發(fā)生降解，比如募集CCR4-NOT復合物或者RNase P/MRP復合物至m6A mRNA使其發(fā)生降解；YTHDF1、YTHDF3調(diào)控靶mRNA的翻譯，YTHDF1募集eIF3蛋白，YTHDF3協(xié)同YTHDF1共同影響靶mRNA的翻譯，當然IGF2BP1、IGFBP2和IGFBP3也會結合m6A修飾轉錄本并增強其穩(wěn)定性（圖4）。
8）如果進行高通量測序之后，靶點的挑選和下游實驗該如何進行？通過上述解答不難看出，對于m6A修飾通常是基因、位點、區(qū)域、功能特異的，因此如果在進行高通量測序之后選擇靶點時，首先應當考慮靶分子的功能，該分子應當同所研究的疾病和生物學過程具有緊密的聯(lián)系（如在肝癌中選擇SOCS2），其次應當考慮該位點相關測序參數(shù)，如甲基化倍數(shù)改變（fold change）和該分子的表達倍數(shù)改變，從上述問題可以明確看到不同的調(diào)控機制給靶基因帶來不同的影響，因此要重點關注轉錄本甲基化水平改變的同時也要關注表達改變，此外還可以結合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行分析，從上述問題中可以發(fā)現(xiàn)部分RBP和轉錄因子本身對m6A修飾也會產(chǎn)生影響，參考其他RBP相關數(shù)據(jù)庫（POSTAR、RMBase等）可以綜合考慮是否在下游實驗設計當中嵌入其他分子（尤其是Reader蛋白），綜合以上信息進行挑選靶點對下游的研究故事完整性有很大幫助。
RNA m6A修飾仍然是當下最火的科研熱點之一，有關RNA m6A的相關研究還在繼續(xù)，我們將在接下來的推送中為大家解決更多具有代表性的科研問題，請各位老師持續(xù)關注。
