晚發(fā)型阿爾茨海默病（Late-onset Alzheimer’s disease,AD）及ADRD是一種復(fù)雜的、主要發(fā)生于老年人且以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。目前發(fā)現(xiàn)circRNA在神經(jīng)元、突觸組織中表達(dá)特異性高[1-3]，與AD的發(fā)病機(jī)制有著密切的聯(lián)系，但是仍存在許多關(guān)鍵問題，大腦區(qū)域及相關(guān)神經(jīng)元中AD相關(guān)因子對circRNA的調(diào)節(jié)尚不清晰，因此，在該領(lǐng)域進(jìn)一步解析其分子調(diào)節(jié)機(jī)理有助于我們對AD致病機(jī)制的理解。

2023年8月，波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院張曉玲團(tuán)隊(duì)在Alzheimers Dement（IF=14.0)發(fā)表文章【Identification of circRNAs linked to Alzheimer’s disease and related dementias】。作者確定了48個(gè)與AD顯著相關(guān)的差異circRNA，發(fā)現(xiàn)circRNA的差異表達(dá)與大腦皮層和海馬體的Tau蛋白病及認(rèn)知能力的喪失相關(guān)。同時(shí)在大腦中發(fā)現(xiàn)三個(gè)circRNA：circAPP、circPSEN1及circMAPK9可以獨(dú)立于其同源的線性信使RNA(mRNA)的變化而受到AD相關(guān)神經(jīng)元應(yīng)激的調(diào)節(jié)。

一、高通量測序鑒定與AD相關(guān)circRNA篩選與差異分析

作者通過對冷凍人腦海馬體組織Illumina NovaSeq測序進(jìn)行RNA-seq分析，從Synapse網(wǎng)站下載西奈山腦庫(MSBB)包括額極（Synapse portal）、顳上回（Superior temporal gyrus）、海馬旁回（Parahippocampal gyrus）、顳下回（ Inferior frontal gyrus）大腦皮層的RNA-seq數(shù)據(jù)，以及從NIAGADS數(shù)據(jù)庫下載成人思維變化海馬體RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用CIRCexplorer3-CLEAR來檢測及定量circRNA，并從人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床嚴(yán)重度及神經(jīng)病理學(xué)信息分析了這210個(gè)病例樣本的臨床特征。通過對這210個(gè)病例進(jìn)行RNA質(zhì)控后，剔除不合格的質(zhì)檢數(shù)據(jù)，選取來207個(gè)樣本進(jìn)行了下游分析，使用STAR將測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組中，并使用CIRCexplorer3識(shí)別反向剪接連接并識(shí)別circRNA，在大腦BM44區(qū)鑒定到4912個(gè)circRNA，通過對海馬體內(nèi)的circRNA的GO富集分析顯示，在249個(gè)差異表達(dá)的circRNA中，有75%的與突觸定位及傳遞相關(guān)，同時(shí)在FDR<0.05的情況下，作者發(fā)現(xiàn)了48個(gè)circRNA在AD和對照之間差異表達(dá)，其中9個(gè)在大腦皮層區(qū)域特異表達(dá)，38個(gè)circRNA在海馬體內(nèi)與皮層共表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)circQKI高表達(dá)，其是一種RBP與內(nèi)含子結(jié)合，調(diào)節(jié)組織/細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT），并且在同時(shí)在海馬體的數(shù)據(jù)集中（ACT），circ（MAPK9、RAPGEF5、NDST3）顯著下調(diào)，circHomer1在皮層的表達(dá)更加豐富，在這三個(gè)AD相關(guān)的數(shù)據(jù)集中都下調(diào)。對這些差異表達(dá)的circRNA對應(yīng)的宿主mRNA進(jìn)行GO/KEGG分析，發(fā)現(xiàn)顯著富集于突觸、突觸后密集區(qū)域、突觸小泡膜蛋白及軸突與神經(jīng)元途徑相關(guān)。

二、差異表達(dá)circRNA與AD患者腦內(nèi)海馬體和大腦皮層的認(rèn)知功能障礙相關(guān)

作者將AD兩個(gè)大腦區(qū)域circRNA的差異表達(dá)模式與臨床癡呆分級(jí)（Clinical Dementia Rating ,CDR）及神經(jīng)病理學(xué)相關(guān)的特征（CERAD神經(jīng)斑塊評分、Braak分期）關(guān)聯(lián)起來，部分差異circRNA在大腦皮層及海馬體內(nèi)的表達(dá)具有偏好相關(guān)性。同時(shí)評估了上述48個(gè)差異表達(dá)的circRNA與Aβ病理（Aβ pathology）、tau蛋白病（tau pathology）及癡呆臨床癥狀評分的相關(guān)性，其中69%的circRNA與上述病理通路相關(guān)，對于選定的circRNA，如：circ（RIMS1、KCNN2、PSMB1、ATRNL1、PDE4B和HOMER1）等，他們都與Braak和CDR評分有顯著的相關(guān)性。

三、血管性或路易體病變改變了AD患者circRNA的差異表達(dá)模式

作者檢測了AD、LBD、和VAD患者的circRNA的表達(dá)模式，與對照組相比，只有39個(gè)circRNA在三種AD類型中表現(xiàn)出共同的差異表達(dá)，且在各級(jí)評分指標(biāo)里，AD-LBD亞型都展示出較大數(shù)量的差異circRNA，進(jìn)一步反映出更嚴(yán)重的神經(jīng)病理特征或突觸病理的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，circRNAs的表達(dá)根據(jù)神經(jīng)病理類型而變化，可能反映了潛在分子調(diào)控途徑的差異。

四、AD相關(guān)GWAS基因/位點(diǎn)的circRNA分析

為了探索與AD通路最密切相關(guān)的circRNA，利用已經(jīng)報(bào)道過的AD相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）檢查了circRNA中的同源基因，其中circ（PICALM、PSEN1）在AD中上調(diào)、circAPP在AD中下調(diào)。同時(shí)相應(yīng)的線性mRNA水平不會(huì)因AD狀態(tài)而改變，這表明AD相關(guān)的circRNA變化獨(dú)立于AD相關(guān)的同源mRNA水平的變化。

五、差異表達(dá)的circRNA實(shí)時(shí)熒光定量分析（qPCR）

作者采用qPCR/Sanger測序等方法驗(yàn)證大腦皮層或海馬區(qū)的11個(gè)顯著差異表達(dá)circRNA，其中circ（KATNAL2、KCNN2、PSMB1、MAPK9）在大腦皮層及海馬體中表達(dá)下調(diào)；其他circ（RIMS1、RAPGEF5、HOMER1、ATRNL1、PDE4B）雖在皮層樣本中顯示出差異，但是在海馬體中沒有顯示出相關(guān)的差異性，可能是作者的樣本起始量較小的原因?qū)е碌摹Ｍ瑫r(shí)還鑒定了其他AD相關(guān)基因產(chǎn)生的circRNA，在大腦皮層中，circAPP顯著下調(diào)，同時(shí)與帕金森病相關(guān)的circSLC8A1也表現(xiàn)出強(qiáng)烈而顯著的下調(diào)。

六、circRNA的分子海綿功能

作者進(jìn)一步預(yù)測了circRNA的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，選取了3個(gè)與AD相關(guān)且與circRNA有豐富共識(shí)序列的miRNA，作者假設(shè)AD病中circAPP的降低會(huì)增加miR-15-5p的表達(dá)，進(jìn)一步抑制靶蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AD樣本中，通過qPCR驗(yàn)證有BDNF等4個(gè)mRNA表達(dá)水平下調(diào)。同時(shí)，在circSLC8A1低表達(dá)中也發(fā)現(xiàn)miR-7-5p調(diào)控的多個(gè)mRNA(GABRA1、G3BP2等)的表達(dá)水平顯著性降低。相反，circPSEN1的增加會(huì)使miR-137的表達(dá)下調(diào)而增加了NFATC1及EGFR的表達(dá)量，進(jìn)一步表明了這些circRNA具有多個(gè)靶基因的調(diào)控機(jī)制。

七、tau蛋白處理下circRNA的表達(dá)變化

接下來，作者進(jìn)一步研究了circRNA的變化是否可以在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)，檢測了其在神經(jīng)元前體細(xì)胞（neuronal precursors cells, NPCs）的表達(dá)，從9月齡PS19-P301S小鼠的大腦中提取寡聚tau蛋白并對NPC細(xì)胞進(jìn)行處理，并且降低了AD相關(guān)的circRNA的表達(dá)（circAPP、circPDE4B、circRAPGEF5、cirmapk9、circRIMS1和circATRNL1），同時(shí)還檢測了與circRNA對應(yīng)的同源mRNA的表達(dá)水平，也出現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象。但是，circMAPK9/circAPP/circPSEN1對應(yīng)的mRNA表達(dá)水平為不變/降低/降低，表明這些circRNA對oTau蛋白具有特異性效應(yīng)。同時(shí)circAPP在oTau蛋白處理下表達(dá)水平下調(diào)，與AD具有相似的表達(dá)水平，也觀察到了IGF1及SNAP25的表達(dá)顯著降低，這暗示了和AD患者相似的生物調(diào)控通路機(jī)制。

總結(jié)

作者研究發(fā)現(xiàn)circRNA在AD病理中具有調(diào)控作用，與大腦皮層及海馬體的Tau蛋白病及認(rèn)知功能障礙相關(guān)，其中circAPP、circPSEN1和circMAPK9獨(dú)立于其對應(yīng)mRNA的變化而受到調(diào)節(jié)，對NPC施加oTau外源處理表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)，進(jìn)一步推測這些circRNA可以成為研究AD疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。

原文鏈接：

https://alz-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/alz.12960

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