基于?RNAi的農(nóng)藥和抗病毒劑：

用于農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的dsRNA?微生物過量生產(chǎn)系統(tǒng)?

隨著全球人口增加和生活水平的提高，生產(chǎn)豐富、優(yōu)質(zhì)、安全的食品變得越來越重要。然而，害蟲和病原體對農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。通過化學(xué)農(nóng)藥保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品免受農(nóng)作物害蟲的侵害，在保障糧食資源方面發(fā)揮了核心作用。然而，許多常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥的各種缺點(diǎn)已經(jīng)變得明顯。例如，由于它們的廣譜作用，它們對傳粉媒介和掠食性瓢蟲等有益昆蟲產(chǎn)生負(fù)面影響，這對生物多樣性構(gòu)成了挑戰(zhàn)。一般來說，合成化學(xué)農(nóng)藥在自然環(huán)境中的分解速度較慢，因此存在化學(xué)農(nóng)藥殘留對生態(tài)系統(tǒng)健康的擔(dān)憂。長期大量使用化學(xué)殺蟲劑，導(dǎo)致害蟲對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生耐藥性。此外，合成化學(xué)農(nóng)藥已被廣泛研究和商業(yè)化，因此，開發(fā)具有新化學(xué)結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新合成農(nóng)藥不再像過去那樣容易。此外，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，尤其是對蝦養(yǎng)殖中，人們擔(dān)心使用大量化學(xué)抗生素和合成抗病毒劑會導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥病原體的生態(tài)影響，因此需要開發(fā)更加自然和環(huán)保的產(chǎn)品。友好的疾病控制劑是令人垂涎的。針對這種情況，歐盟（EU）2020年報告《從農(nóng)場到餐桌的戰(zhàn)略》呼吁將化學(xué)農(nóng)藥的總體使用和風(fēng)險減半，畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用2030。最有希望的替代品之一是基于?RNAi?的殺蟲劑和?RNAi?試劑。?這種基于?RNAi?的產(chǎn)品的功能成分是具有雙鏈結(jié)構(gòu)的?RNA?分子?(dsRNA)。其作用基于?RNA?干擾?(RNAi)?機(jī)制，當(dāng)?dsRNA?被吸收到具有?RNAi?能力的細(xì)胞中時，RNAi?以核苷酸序列特異性方式特異性抑制靶基因的表達(dá)（圖?1?）。換言之，基于?RNAi?的農(nóng)藥通過?RNAi?效應(yīng)抑制對目標(biāo)作物害蟲生存至關(guān)重要的基因的表達(dá)，從而抑制害蟲的生命，甚至導(dǎo)致死亡。因此，此類農(nóng)藥也被稱為“RNA誘導(dǎo)的基因沉默農(nóng)藥”。

基于?RNAi?的農(nóng)藥和抗病毒劑的應(yīng)用大致可分為兩類：建立表達(dá)作用于目標(biāo)害蟲的?dsRNA?的轉(zhuǎn)基因植物，以及將?dsRNA?外源（局部）應(yīng)用于植物體（例如，通過葉面噴施）噴霧、灌溉或樹干注射）。前者是一種利用轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行害蟲管理的方法，后者是一種非轉(zhuǎn)化的?dsRNA?傳遞。本綜述的重點(diǎn)是生產(chǎn)用于局部給藥的?dsRNA，特別是用于作物葉面噴灑。另外，還討論了可應(yīng)用于養(yǎng)蝦飼料的?dsRNAs?形式的生產(chǎn)。

使用基于?RNAi?的殺蟲劑作為殺蟲劑的第一個優(yōu)點(diǎn)是它們基本上只抑制目標(biāo)害蟲的生長。由于設(shè)計了特異性抑制要?dú)⑺阑蛞种频暮οx中靶基因表達(dá)的核苷酸序列，因此基于RNAi的農(nóng)藥不應(yīng)影響非預(yù)期（非靶）昆蟲；這種方法有利于生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。第二個優(yōu)勢是作為殺蟲劑的有效因子的?RNA，由于其固有的化學(xué)不穩(wěn)定性和核酸酶在生物生態(tài)群落中的普遍存在而在環(huán)境中相當(dāng)快地降解。同樣，基于?RNAi?的殺蟲劑的這一特性與生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)基本一致。然而，適度控制可降解性是?dsRNA?在局部施用于農(nóng)作物的殺蟲劑中實際應(yīng)用的一個重要方面。基于?RNAi?的殺蟲劑的第三個有價值的特征是它們的應(yīng)用允許對新出現(xiàn)的害蟲疾病和對已經(jīng)使用的殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的害蟲做出靈活和快速的反應(yīng)。即使目標(biāo)害蟲對所使用的基于?RNAi?的農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，原則上可以通過簡單地靶向同一基因的另一個區(qū)域或通過改變害蟲中的目標(biāo)基因來快速開發(fā)一種新的基于?RNAi?的農(nóng)藥?.然而，在這方面，由于涉及?RNAi?作用的潛在機(jī)制的基因突變，最近報道了一種強(qiáng)大的抗性害蟲的出現(xiàn)；這將在下面具體討論。

評估這些創(chuàng)新的基于?RNAi?的殺蟲劑和抗病毒劑的實際應(yīng)用對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的影響仍然至關(guān)重要（就像使用傳統(tǒng)殺蟲劑一樣）。然而，該技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用的直接實際問題是：（i）需要大幅降低生產(chǎn)成本；?(ii)?改進(jìn)對作物害蟲等目標(biāo)生物體的施用方法（這也與產(chǎn)品成本問題有關(guān)），以及?(iii)?選擇不會導(dǎo)致脫靶效應(yīng)的?RNA?序列，即不發(fā)揮作用的?RNA?序列在目標(biāo)害蟲的特定基因以外的基因上。最緊迫的挑戰(zhàn)是將?dsRNA?生產(chǎn)成本降低到可以將基于?RNAi?的產(chǎn)品投入實際商業(yè)應(yīng)用的水平。用于農(nóng)田和水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘所需的?RNA?量是巨大的，因此，必須找到以經(jīng)濟(jì)可行的方式生產(chǎn)大量?dsRNA（設(shè)計的核苷酸序列為幾百個堿基對）的方法。??

這篇綜述概述了最近使用代表性微生物大腸桿菌、丁香假單胞菌、谷氨酸棒狀桿菌和萊茵衣藻作為宿主菌株生產(chǎn)?dsRNA（包括發(fā)夾型?RNA?物種，hpRNA）的方法，如以及使用其他一些微生物的研究結(jié)果。在大腸桿菌中，有許多關(guān)于使用大腸桿菌噬菌體?T7?轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)生產(chǎn)具有部分雙鏈結(jié)構(gòu)的?hpRNA?和?dsRNA?的報道。已開發(fā)出一種結(jié)合丁香假單胞菌及其噬菌體?phi6?的獨(dú)特系統(tǒng)，以提高?dsRNA?產(chǎn)物的穩(wěn)定性。最近使用工業(yè)微生物谷氨酸棒桿菌建立了一個高水平的?dsRNA?生產(chǎn)系統(tǒng)，谷氨酸棒桿菌是一種“公認(rèn)安全”（GRAS）菌株。使用光合微藻?Chl?生產(chǎn)?dsRNA?的研究結(jié)果。?reinhardtii?已被報道，特別是在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。除了這些生物之外，最近報道了使用各種酵母、乳酸菌和共生微生物生產(chǎn)?dsRNA?的研究案例，用于害蟲防治。

隨著制造技術(shù)的改進(jìn)，RNA?的生產(chǎn)成本逐年下降。一家名為?RNAgri（前身為?APSE）的生物技術(shù)公司開發(fā)了一種技術(shù)，可以以?1-2?美元/g RNA?的成本生產(chǎn)?dsRNA。他們的生產(chǎn)系統(tǒng)聲稱基于大腸桿菌中病毒樣顆粒?(VLP)?中目標(biāo)?dsRNA?的積累。噬菌體?MS2?的外殼蛋白?(CP)?和含有包裝位點(diǎn)?(PSs)?的目標(biāo)?dsRNA?的前體同時表達(dá)。?CP?和?PS?將?RNA?結(jié)合并封裝在?VLP中。?GreenLight Biosciences?用于生物分子合成的無細(xì)胞系統(tǒng)中的?RNA?生產(chǎn)也引起了人們的關(guān)注。一般來說，無細(xì)胞系統(tǒng)中?RNA?生產(chǎn)的主要障礙是作為?RNA?構(gòu)建塊的四種核糖核苷三磷酸?(NTP)?的高成本。該公司通過使用核酸酶將源自酵母生物質(zhì)的核酸降解為構(gòu)成單體，從而實現(xiàn)了目標(biāo)?RNA?的低成本生產(chǎn)。

本綜述中描述的?dsRNAs?的微生物生產(chǎn)方法可用于從可持續(xù)原材料中大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)?dsRNAs?？偨Y(jié)了一些描述目標(biāo)?dsRNA?生產(chǎn)力的代表性研究。所采用的方法必須針對特定需求進(jìn)行調(diào)整；有必要根據(jù)其用途和實際要求為每種基于?RNAi?的產(chǎn)品建立優(yōu)化的生產(chǎn)方法。諸如使用生產(chǎn)微生物作為膠囊以保護(hù)目標(biāo)?dsRNA?免受意外降解，或使用微生物本身作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的補(bǔ)充營養(yǎng)物等方面，可能會增加基于?RNAi?的試劑的價值?；?RNAi?的產(chǎn)品有助于解決現(xiàn)在和未來與安全可靠的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)相關(guān)的各種問題；換言之，實現(xiàn)“可持續(xù)農(nóng)業(yè)”?；?RNAi?的殺蟲劑將有助于保護(hù)和維持自然生態(tài)系統(tǒng)，并將極大地幫助建立“可持續(xù)農(nóng)業(yè)”。同樣，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，dsRNA?物種的抗病毒作用將減少化學(xué)抗病毒藥物的廣泛使用，這些藥物具有廣泛的活性，有助于建立“可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖”。?? ?

本綜述主要總結(jié)了基于?RNAi?的產(chǎn)品實際應(yīng)用的第一個技術(shù)障礙。但是，還必須考慮更廣泛的問題。為了實現(xiàn)基于?RNAi?的產(chǎn)品的好處，農(nóng)產(chǎn)品消費(fèi)者、基于?RNAi?的產(chǎn)品用戶（農(nóng)民）和?RNA?農(nóng)藥生產(chǎn)者之間的溝通對于確?；诨?RNAi?的產(chǎn)品的科學(xué)證據(jù)。然后，需要適當(dāng)?shù)墓芾?、監(jiān)督和立法，基于?RNAi?的產(chǎn)品必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)陌踩u估和批準(zhǔn)程序。噴霧或外用?dsRNA?殺蟲劑正在開發(fā)中，但目前還沒有專門針對此類基于?RNAi?的殺蟲劑的法律法規(guī)。歐盟或美國沒有具體的指導(dǎo)文件來定義批準(zhǔn)基于?dsRNA?的農(nóng)藥的數(shù)據(jù)要求。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織?(OECD)已就這一問題提出了第一次審查和建議。? ? ? ?

一旦可以采購到低成本的?dsRNA，各種基于?RNAi?的產(chǎn)品不僅可以實際應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖，還可以用于防治蟑螂、火蟻、白蟻和傳染病媒介等衛(wèi)生害蟲.?通過這種方式，可持續(xù)的基于?RNAi?的產(chǎn)品有望對人類的生活產(chǎn)生有益的影響。氣候變化將促進(jìn)令人生畏的農(nóng)作物害蟲的傳播和傳播?？梢詰?yīng)對農(nóng)作物害蟲引起的潛在糧食危機(jī)的環(huán)保害蟲防治方法極為重要，基于?RNAi?的產(chǎn)品有望在應(yīng)對這一挑戰(zhàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

原文鏈接：

https://doi.org/10.3390/app12062954