一、吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色實驗簡介

吖啶橙(AO)能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴化乙錠（EB）能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細胞呈現(xiàn)為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者形態(tài)迥然相異，很易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細胞形態(tài)：活細胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細胞(NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；晚期凋亡細胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

二、實驗所需材料及試劑

吖啶橙、溴化乙錠、PBS等

三、實驗步驟

（1）細胞爬片：在6孔培養(yǎng)板中預先置入玻璃蓋玻片，接種細胞懸液，干預后，予95%乙醇固定15分鐘，微干，然后準備熒光染色。將100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙錠各5μl（臨用前混合加入，加樣量宜小，有時各2μl-5μl足夠，量太大容易形成細胞凋亡的假陽性），在照相前混勻后加入，輕輕吹打，30秒后用激光共聚焦顯微鏡觀察照相。 （有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中過濾，避光保存）計取5個視野，共100個細胞中凋亡細胞百分數(shù)。

（2）制作細胞懸液：取100μl PBS稀釋的細胞懸液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后觀察攝像。（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。細胞離心，懸液于PBS中，取100μl細胞懸液加4μl熒光染色液，輕輕吹打，滴至載玻片上，加蓋玻片后立即置熒光顯微鏡下觀察。）

四、實驗所需試劑清單

序號 產(chǎn)品名 ? ? ? ? ? ? 貨號 CAS 備注

1 PBS緩沖液 HC2031

2 丫啶橙 ? ? ? ? ? ? SS2148 10127-02-3

3 溴化乙錠 SS0623 1239-45-8