一、相關(guān)概念

1.?GEO

詳見https://zhuanlan.zhihu.com/p/344426350

GEO Platform (GPL) ?用戶測序使用的芯片or平臺；

GEO Sample (GSM) ?用戶提交給GEO的樣本數(shù)據(jù)；

GEO Series (GSE) ?一個完整的研究

一篇文章可以有一個或者多個GSE數(shù)據(jù)集；?

一個GSE數(shù)據(jù)集里面可以有一個或者多個GSM樣本；?

每個數(shù)據(jù)集都有著自己對應(yīng)的芯片平臺，就是GPL。

2.CEL格式文件

.CEL文件是由Affymetrix DNA微陣列圖像分析軟件創(chuàng)建的數(shù)據(jù)文件。它包含從Affymetrix基因芯片上的“探針”提取的數(shù)據(jù)，可以存儲數(shù)千個數(shù)據(jù)點，這可能會使它的文件大小變大。

.CEL 文件可以通過軟件算法處理，并作為整體基因組實驗的一部分在二維網(wǎng)絡(luò)上可視化。

Affymetrix基因芯片是一種生物芯片，它包含一個對一個實驗有效的微陣列。為了制造這些芯片，玻璃或硅載玻片上排列有探針，根據(jù)它們是否與原始DNA樣本互補，探針將表達水平(強度)報告為完全匹配(PM)和不匹配(MM)值。這些值可用于研究DNA的改變，稱為單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，用于人類和動物疾病的研究。

.CEL 文件格式有多個版本，使用不同的格式。例如，版本3使用ASCII文本格式，而版本4使用二進制格式。

注意：.CEL 文件需要相應(yīng)的.CDF 文件，它是存儲在.CEL 文件中的原始探測級數(shù)據(jù)的字典。MATLAB有一個名為affyread的內(nèi)置函數(shù)，可以用來讀取Windows版本軟件中的.CEL 文件。

3.基因表達水平

一個基因表達水平的直接體現(xiàn)就是其轉(zhuǎn)錄本的豐度情況，轉(zhuǎn)錄本豐度越高，則基因表達水平越高。

RNA-seq分析中，可以通過定位到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的測序序列(reads)的計數(shù)來估計基因的表達水平。Reads計數(shù)除了與基因的真實表達水平成正比外，還與基因的長度和測序深度成正相關(guān)。

為了使不同基因、不同實驗間估計的基因表達水平具有可比性，引入了FPKM的概念。

FPKM 是每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目，它同時考慮了測序深度和基因長度對fragments計數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達水平估算方法。

二、使用GEO2R分析差異表達

GEO2R是NCBI自帶的傻瓜式分析工具。

在GEO頁面最下方，點擊【Analyze with GEO2R】即可快速進行分析。

選擇分組信息后進行分析，即可出結(jié)果，有多種圖像以及顯著差異基因表格文件。

注意分組時需要保證只有一個變量。

詳細操作見https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/108079349?

以及https://zhuanlan.zhihu.com/p/323711071

GEO2R也是基于R的limma包進行分析的，在分組頁面可以查看R腳本，還可以修改部分參數(shù)。

三、用R語言分析差異表達

有很多包可以使用，如DESeq2、limma、edgeR、WGCNA、lefse等等。

此處僅演示limma。