解析 | 做科研的大師兄

經典的腫瘤單基因研究思路是：通過數據分析（比如癌和癌旁差異表達、生存預后分析、單細胞數據進行細胞類型特異性表達、基因表達與各種基因集評分相關性等），找到一個與腫瘤進展密切相關的基因，然后在腫瘤細胞中進行該基因的敲除、過表達或用抑制劑，進行體內、體外的功能實驗，證實這個基因在腫瘤進展中的作用。表型確證后，再進行組學，找到機制研究的切入點，闡明功能背后的機制。這種井底那思路的課題研究結果寫成文章，標題往往就是xx基因通過調控xx介導了xx進而促進/抑制xx腫瘤進展/逃逸。

我們知道，一個課題的研究結果寫成文章之后，就是要講述一個story，并且打動、說服editor和reviewers，才能有機會發(fā)表。經典的腫瘤單基因研究思路類似于八股文的框架，針對不同文章如果只是換個基因和癌種，用類似的經典研究思路來寫成一個story，不僅內容框架，而且題目框架，難免落入千篇一律的即視感，給審稿人和編輯的第一印象容易落入俗套，缺乏新意。

因此，近兩年，我們在主刊或者大子刊上面的文章很少看到此類經典思路，越來越多的都是在這層思路的基礎上進行邏輯重新構建，講述一個更加具有吸引力和創(chuàng)新度的story，以此贏得頂刊青睞，提高發(fā)表更高水平文章的機率。

那我們今天就帶大家看一篇大子刊的文章如何針對經典的腫瘤單基因研究重建邏輯架構，打造一個更有吸引力的story，并實現成功發(fā)表的。

這篇文章是剛剛在Cell子刊Cell Metabolism提前發(fā)表上的一篇研究論文。

通過Title，可以看到這篇文章主要講述了一個腫瘤糖酵解通過調控T細胞分泌TNF-α介導的殺傷產生免疫逃逸的story。

接著我們這篇文章如何切入的，如上Figure 1A-C。可以看到這篇文章通過Crispr-cas9 sgRNA文庫篩選的方法，引出腫瘤細胞在面對CD8 T細胞殺傷作用時通過調控哪些通路發(fā)揮抵抗作用（免疫逃逸），進而發(fā)現與CD8 T細胞進行共培養(yǎng)時，腫瘤細胞中的糖酵解相關的通路顯著上調（B、C圖中的藍色字體標注的基因都是糖酵解通路的），提示了腫瘤細胞通過糖酵解過程產生針對CD8T殺傷的免疫逃逸。

既然通路確定了，接著進一步明確通路中的哪個關鍵基因作為功能和機制研究的切入點。于是這里繼續(xù)進行sgRNA文庫篩選數據分析，此時可以比較Figure 1A中control腫瘤細胞（不表達OVA，不能被CD8 T識別及殺傷）和control腫瘤細胞+CD8 T共培養(yǎng)后的腫瘤細胞中的sgRNA豐度,找到不影響腫瘤細胞增殖，但是又影響腫瘤細胞逃避CD8 killing的基因。最終聚焦到Slc2a1（因為這個基因不影響腫瘤細胞增殖—上圖B—C箭頭指出基因，但是可以促進腫瘤細胞免疫逃逸—Figure 1B-C藍色指出基因）。

由此找到本課題中一個非常明確的腫瘤細胞基因的切入點，那就是腫瘤細胞中Glut1（編碼基因是Slc2a1）在其針對CD8 T細胞killing中的作用及機制研究。而這就進入了我們大家非常熟悉的，做爛了的經典的腫瘤單基因研究思路了，就是在腫瘤細胞敲除Glut1，或者利用抑制劑抑制Glut1（主要表達在腫瘤細胞上），然后體內、體外證實其介導腫瘤細胞免疫殺傷逃逸的功能（如下圖）。

敲除+抑制劑：體外實驗證實功能

敲除：體內證實功能

并在功能確定的基礎上，進行第二輪的sgRNA文庫篩選，找到Glut1通過抑制腫瘤細胞中TNF-α通路（如下圖G，紅色字體為TNF-α介導凋亡通路）介導的凋亡進而導致免疫逃逸。

在此基礎上，為了將機制進一步加深，再進行了一次組學（RNA-seq）,比較了Glut1抑制之后，可以顯著激活的轉錄因子是ATF4，而這個基因是氧化磷酸化的關鍵基因，導致ROS生成。文獻關聯(lián)，ROS可以激活TNF-α介導的凋亡通路。因此證實了腫瘤細胞上調Glut1是可以導致ROS減少，進而抑制CD8 T細胞釋放的TNF-α介導的腫瘤細胞凋亡。

這是整個文章要講述的story，也是這篇文章證明的work model如下圖。

誠然，以上是本文章給我們呈現的講述一個比較有新意、有意義的story的邏輯框架，這種框架的課題切入角度甚至題目，并不是我們研究爛了的腫瘤單基因研究思路，而是通過看起來更靠譜更有說服力的針對共培養(yǎng)體系腫瘤細胞，sgRNA文庫組學篩選切入，先找到代謝通路，再鎖定關鍵基因。但是，這真的是本研究邏輯展開的真實再現嗎？

我的判斷，肯定不是！為什么？這就需要我們辯證性思考閱讀了。

文章邏輯起點還原之如何將研究爛了的腫瘤單基因套路進行邏輯重建！

其實精讀過本文全文之后，我們可以看到本研究的核心點就是腫瘤細胞中Glut1介導其針對CD8 T細胞殺傷的免疫逃逸功能及機制。這無疑是非常經典的，甚至研究爛了的腫瘤單基因課題思路。

試想如果我們拿到這個課題結果，我們如何寫文章？大概率還是會按照我們在開頭說的那種經典思路先寫腫瘤細胞中Glute1的特異高表達及其與生存預后相關性，再做敲除、過表達及抑制劑處理后的體外、體內功能驗證，再去找機制等等；最終我們的題目大概率就是Glut1通過抑制ROS生成抑制CD8T細胞分泌TNF-α介導的腫瘤細胞凋亡進而促進免疫逃逸。

當然這種經典的寫法無可厚非，但是從意義以及新穎性上來看，明顯很套路，單基因意義有限，這就會在審稿人和editor評估稿件時留下不好印象，很難弄發(fā)表到高質量期刊。

我們再對比，這篇文章之所以成功發(fā)表在Cell子刊，他與我們的經典思路又很不同，這些不同點就決定了發(fā)表期刊的高度。通過對比可知，這篇文章開頭是從更為宏大的表型出發(fā)，利用腫瘤細胞+CD8T細胞共培養(yǎng)體系，基于sgRNA文庫篩選，找到糖酵解通路，并再縮小范圍到這個單基因Glut1上來。這就相當于對于研究爛了的腫瘤單基因套路進行了包裝，找到了一個更加新穎，看起來更有說服力的帽子來開局。這種包裝就大大提升了課題高度。并且在文章題目中也有體現，因為開頭用的是更宏大的表型篩選，先找到的通路，所以文章題目講的是糖酵解而不是一個具體的單基因，這樣一來，文章的意義就進一步提升。

接下來的問題是，為什么我會覺得這篇文章的開頭是最后為腫瘤單基因套路加的一個更華麗的帽子呢？有的小伙伴可能覺得，沒準人家就是這么開始做的呀？

好，我們來看證據！

這Figure 1的B-C圖相信大家還記得吧，馬腳在這里。為什么這么講？仔細思考一下，這里通過sgRNA文庫篩選找到了糖酵解通路（也就是B和C圖中藍色字體的基因），這個篩選是絕對合理的嗎？顯然不是。因為sgRNA顯著改變的，藍色字體基因所在象限還有更多的基因，這些基因顯然也會富集到某條通路上，可能是其他代謝通路。然而，本文并未展示在所有下調sgRNA中，顯著富集的通路有哪些，是否糖酵解通路就是最明顯富集的？這部分數據是缺失的，這就說明了，這里挑選出糖酵解通路，只是為了下一步找出Glut1的編碼基因Slc2a1，將課題從大表型開局過渡到單基因套路上去。這就是包裝過程！

本研究不論是經典的單基因功能、機制研究思路，還是組學數據篩選策略找到目的靶標，以及如何針對研究爛了的經典單基因思路找一個更牛B的開局，都是值得我們仔細學習的！

文章全文下載，公眾號BioAdvance后臺回復：GLUT1

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