寫在前面

????????今天推薦的是由同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院團隊在2019年2月發(fā)表于CellResearch（IF：17.916，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Ping Wang教授，研究表明Rheb介導(dǎo)的mTORC1激活是由Rheb泛素化和去泛素化之間的動態(tài)對立事件調(diào)控的。

研究背景

????????mTORC1是所有真核生物中保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在整合各種環(huán)境信號調(diào)節(jié)細胞生長和代謝中起著關(guān)鍵作用。mTORC1復(fù)合體由mTOR、mLST8和Raptor組成，是Raf-MEK-ERK和PI3K-PDK1-AKT信號通路的下游節(jié)點。激活的mTORC1可以磷酸化包括S6K、4EBP1、ULK1和TFEB在內(nèi)的多種底物。mTOR信號失控與多種疾病密切相關(guān)，包括癌癥、代謝性疾病和發(fā)育障礙。因此，在正常情況下，mTOR在多個水平上受到嚴格控制。

????????作為對各種環(huán)境信號的響應(yīng)，mTORC1在溶酶體上通過兩種Ras相關(guān)的小G蛋白Rheb-和Rag-GTPase相互作用而被激活。然而，目前關(guān)于Rheb活性的調(diào)控機制仍知之甚少。TSC復(fù)合體被認為是Rheb的主要上游調(diào)節(jié)因子，該復(fù)合物通過將Rheb從活性形式(GTP結(jié)合的Rheb)轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚孕问?GDP結(jié)合的Rheb)來負調(diào)控mTORC1的活性。最近的研究表明，E3連接酶RNF152和SKP2介導(dǎo)的RagA的k63多泛素化強烈抑制mTORC1的活化，同時，TRAF6介導(dǎo)mTOR的K63泛素化是mTORC1激活所必需的。

摘要部分

????????作者發(fā)現(xiàn)，Rheb的泛素化控制著它與核苷酸的結(jié)合狀態(tài)。研究表明，溶酶體錨定的E3連接酶RNF152催化Rheb的泛素化并促進其與TSC復(fù)合物結(jié)合。另外，EGF通過AKT依賴的USP4磷酸化促進Rheb的去泛素化，導(dǎo)致Rheb從TSC復(fù)合體中釋放出來。這表明，在功能上，Rheb的泛素化與mTORC1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)腫瘤的生長。因此，作者提出了一個機制模型，其中Rheb介導(dǎo)的mTORC1激活是由Rheb的泛素化和去泛素化之間的動態(tài)對立事件決定的，而Rheb泛素化和去泛素化分別由RNF152和USP4催化。作者的研究結(jié)果還揭示了關(guān)于mTORC1激活介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生機制，該研究結(jié)果可能有助于未來癌癥治療的研究。

研究內(nèi)容

1.TSC復(fù)合物和EGF信號調(diào)控Rheb的泛素化??? ?

????????作為mTORC1信號通路的關(guān)鍵負調(diào)控因子，TSC復(fù)合物主要作為GAP使RhebGTPase失活。然而，作者發(fā)現(xiàn)TSC1、TSC2或TBC1D7的表達促進了HEK293T細胞中Rheb的泛素化。作者使用泛素突變體（R72A：不能被泛素激活酶E1激活）作為陰性對照，證實了TSC2可誘導(dǎo)Rheb的泛素化。此外，數(shù)據(jù)顯示敲低TSC1或TSC2會降低Rheb的泛素化水平，這說明內(nèi)源性TSC復(fù)合體介導(dǎo)了Rheb的泛素化。

????????鑒于TSC2是Rheb的GAP，作者研究了TSC2的GAP功能是否參與調(diào)控Rheb泛素化。數(shù)據(jù)表明，缺乏GAP活性的突變體TSC2-3Q喪失了促進Rheb泛素化的能力，并且不能抑制mTORC1的活化。說明Rheb的泛素化依賴于TSC復(fù)合物的GAP活性。? ? ?

????????為了確定是哪種類型的泛素鏈錨定在Rheb上，作者在293T細胞中共表達Rheb和不同賴氨酸突變的泛素突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有泛素突變體的表達都對TSC2誘導(dǎo)的Rheb泛素化沒有影響。這表明TSC2可能主要促進Rheb的單泛素化。

????????眾所周知，TSC對Rheb活性受生長因子調(diào)控。數(shù)據(jù)顯示，EGF處理降低了內(nèi)源性和外源性Rheb的泛素化水平。另外，作者通過純化細胞內(nèi)溶酶體來檢測Rheb是否在溶酶體上被泛素化，并發(fā)現(xiàn)溶酶體Rheb在饑餓時確實發(fā)生大量泛素化，而當(dāng)EGF處理時，其泛素化被抑制。

????????由于TSC2可以使Rheb失活并促進其從GTP-結(jié)合形式轉(zhuǎn)化為GDP-結(jié)合形式，作者研究了Rheb泛素化是否受其核苷酸結(jié)合狀態(tài)的影響。數(shù)據(jù)顯示，Rheb失活突變體的泛素化作用遠強于其活性突變體，表明泛素化與Rheb失活密切相關(guān)。

研究結(jié)論：Rheb泛素化需要TSC復(fù)合物的GAP活性，其中TSC2可能主要促進Rheb的單泛素化。另外，Rheb的泛素化與其失活密切相關(guān)，而EGF處理會抑制Rheb的泛素化。

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2.RNF152是Rheb的E3泛素連接酶

????????作者篩選了一組E3連接酶，以確定催化Rheb泛素化的特異性E3連接酶。作者發(fā)現(xiàn)溶酶體的RNF152的過表達會誘導(dǎo)Rheb的泛素化，而在RNF152敲除的細胞系中，內(nèi)源性和外源性Rheb的泛素化水平均降低。另外，作者還從大腸桿菌中純化了RNF152和Rheb并進行體外泛素化試驗。數(shù)據(jù)表明RNF152在體外可對Rheb進行泛素化。

????????接下來作者檢查RNF152是否可以與Rheb相互作用。免疫共沉淀和體外下拉實驗結(jié)果均顯示RNF152可以與Rheb相互作用。作者還發(fā)現(xiàn)，與Rheb-GTP相比，RNF152會優(yōu)先結(jié)合到Rheb-GDP上，這表明Rheb和RNF152之間的相互作用受Rheb的核苷酸結(jié)合狀態(tài)的影響。一系列的研究數(shù)據(jù)表明，RNF152是Rheb的直接結(jié)合伴侶分子。

????????為了定位RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化位點，作者檢測了RNF152介導(dǎo)不同Rheb突變體的泛素化效果。數(shù)據(jù)顯示，RNF152誘導(dǎo)的Rheb-K8R的泛素化減少，但其他突變體沒有減少，這表明Rheb的K8殘基是其泛素化的主要位點。

?研究結(jié)論：RNF152作為E3泛素連接酶可與Rheb相互作用并促進其泛素化，Rheb的K8殘基是其泛素化的主要位點。

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3.RNF152參與TSC2介導(dǎo)的Rheb泛素化?
????????作者接下來研究了RNF152是否參與TSC2介導(dǎo)的Rheb泛素化。數(shù)據(jù)顯示RNF152的過表達增強了TSC2介導(dǎo)的Rheb泛素化，而RNF152缺失則導(dǎo)致TSC2誘導(dǎo)的Rheb泛素化水平下降。此外，TSC2存在的情況下Rheb-K8R突變體的泛素化被抑制。這些數(shù)據(jù)共同表明，TSC2介導(dǎo)的Rheb泛素化在很大程度上依賴于RNF152。

????????作者發(fā)現(xiàn)，野生型TSC2可以促進RNF152和Rheb之間的相互作用，而失去GAP活性的TSC2突變體則不行。另外實驗顯示，TSC2的缺失抑制了RNF152誘導(dǎo)的Rheb泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，TSC2以TSC2-GAP活性依賴的方式促進Rheb與RNF152的結(jié)合。

????????作者還研究了RNF152和Rheb之間的相互作用是否依賴于Rheb的核苷酸結(jié)合狀態(tài)。數(shù)據(jù)顯示RNF152與Rheb的失活突變體的結(jié)合比其與活性突變體的結(jié)合強得多。這些結(jié)果與另一數(shù)據(jù)一致，即RNF152和Rheb之間的相互作用被EGF抑制，并誘導(dǎo)Rheb處于GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。

?研究結(jié)論：TSC復(fù)合物或去除EGF會誘導(dǎo)GDP結(jié)合Rheb，從而促進Rheb和RNF152之間的相互作用并導(dǎo)致Rheb泛素化。

4.USP4介導(dǎo)Rheb的去泛素化

????????為鑒定Rheb的去泛素化酶，作者對多種DUBs進行了篩選，并發(fā)現(xiàn)USP4、USP5、USP11、USP15和USP22等多個DUBs的過表達可以去除Rheb上連接的泛素鏈。然而，數(shù)據(jù)顯示只有USP4與Rheb相互作用，而且USP4的DUSP結(jié)構(gòu)域是其與Rheb相互作用所必需的。

????????作者接下來探究USP4是否為Rheb的去泛素化酶。數(shù)據(jù)顯示，野生型USP4的過表達抑制了TSC2/RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化，而其無酶活突變USP-CS不能抑制。作者還發(fā)現(xiàn)USP4和RNF152在與Rheb的相互作用中沒有競爭關(guān)系。用Vialinin A（一種抑制USP4的DUB活性的小分子）處理可以抑制USP4介導(dǎo)的Rheb去泛素化并提升Rheb的泛素化水平。另外，體外去泛素化試驗顯示，USP4可以在體外直接對Rheb進行去泛素化。

?研究結(jié)論：USP4可以直接對Rheb進行去泛素化，即USP4是Rheb的直接去泛素化酶。

5.生長因子通過USP4磷酸化調(diào)控Rheb的泛素化? ??? ?

????????作者探究了USP4與Rheb的相互作用是否受EGF的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGF處理在內(nèi)源和外源水平均促進了它們的相互作用。據(jù)報道，EGF可誘導(dǎo)AKT磷酸化USP4，于是作者設(shè)計了USP4去磷酸化（USP4-S445A）和磷酸化（USP4-S445D）模擬突變體。研究顯示USP4-S445A幾乎不與Rheb結(jié)合，相反，Rheb和USP4-S445D突變體之間的相互作用很容易檢測到。另一方面，USP4-WT和USP4-S445D的過表達也降低了TSC2/RNF152誘導(dǎo)的Rheb泛素化水平。此外，實驗表明，AKT抑制劑（MK2206）破壞了USP4和Rheb之間的相互作用，并促進Rheb泛素化。

?研究結(jié)論：EGF可以促進USP4與Rheb的相互作用，并通過誘導(dǎo)USP4的S445磷酸化來調(diào)控Rheb的去泛素化。

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6.Rheb的泛素化抑制其活性

????????泛素化除了作為蛋白水解信號使底物靶向到蛋白酶體降解，還可以作為調(diào)節(jié)靶蛋白活性的信號。作者的數(shù)據(jù)顯示RNF152和TSC2都不能影響Rheb蛋白的穩(wěn)定性，進一步的研究表明，Rheb的單泛素化不參與其降解。? ? ?
????????然后作者使用GTP下拉實驗研究Rheb泛素化是否對其激活有影響。數(shù)據(jù)顯示，RNF152的敲除誘導(dǎo)Rheb活化。另外，Rheb-K8R與GTP的結(jié)合能力比Rheb-WT更強，而且TSC2未能使Rheb-K8R失活。這些都表明，泛素化負調(diào)控Rheb的激活。

????????作者接下來探究了USP4是否參與Rheb活化。數(shù)據(jù)顯示，USP4的缺失以及Vialinin A對USP4活性的抑制降低了Rheb的活性。這表明USP4的去泛素化酶活性是Rheb活化所必需的。同時，USP4-WT和USP4-S445D的表達促進了Rheb的活化，而USP4-S445A的表達不能。

?研究結(jié)論：RNF152對Rheb的泛素化抑制了Rheb的激活，而USP4通過去泛素化促進Rheb激活，且這一過程受EGF調(diào)控。

7.Rheb的泛素化促進其與TSC2相互作用

????????接下來作者研究了Rheb泛素化是否影響其與TSCs的相互作用。數(shù)據(jù)顯示，泛素化的Rheb與TSC2的結(jié)合能力增強。另外，與Rheb-WT相比，Rheb-K8R突變體與TSC2的結(jié)合親和力要弱得多。這些數(shù)據(jù)共同表明，Rheb的K8位點的泛素化增強了其與TSC2的結(jié)合。

????????作者還研究了RNF152是否影響TSC和Rheb之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)RNF152缺失時，Rheb和TSC之間的相互作用減少。與此一致，RNF152促進了Rheb與TSC2的結(jié)合。此外，USP4的過表達阻斷了Rheb和TSC2之間的相互作用。

????????近期研究表明，TSC復(fù)合物在溶酶體中通過與Rheb的相互作用抑制Rheb的激活。作者的數(shù)據(jù)顯示，TSC2和LAMP2（溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2）的共定位在RNF152敲除的細胞中減少，而USP4敲除細胞中觀察到了相反的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化增強了其與TSC2的結(jié)合，同時，USP4從Rheb中去除泛素并促進TSC與Rheb分離。

?研究結(jié)論：Rheb的泛素化可促進其與TSC2的相互作用，而去泛素化則促進TSC與Rheb的分離。

8.Rheb的泛素化抑制mTORC1的激活

????????先前的研究揭示了Rheb在EGF刺激下的mTORC1活化中起關(guān)鍵作用。因此，作者通過檢測S6K、S6和/或4EBP1的磷酸化水平來檢測Rheb泛素化是否調(diào)控mTORC1的激活。數(shù)據(jù)顯示，MEFs中RNF152的缺失促進了EGF誘導(dǎo)的mTORC1激活，而RNF152的過表達則起抑制作用。在EGF處理后，Rheb-K8R細胞顯示出比Rheb-WT更強的激活mTORC1的能力。此外，Rheb-K8R介導(dǎo)的mTORC1激活對TSC2和RNF152的抑制作用具有抵抗力，這表明TSC2/RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化以EGF敏感的方式負調(diào)節(jié)mTORC1的激活。

????????作者還探究了USP4是否對EGF誘導(dǎo)的mTORC1激活有影響。數(shù)據(jù)顯示，USP4-WT的過表達促進EGF依賴的mTORC1激活，而USP4-CS不能。各種細胞中USP4的缺失則抑制了EGF誘導(dǎo)的mTORC1激活。此外，USP4抑制劑Vialinin A處理幾乎完全阻斷了EGF誘導(dǎo)的S6K、S6和4EBP1的磷酸化。

?研究結(jié)論：TSC2/RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化會抑制mTORC1激活，而USP4介導(dǎo)的Rheb去泛素化則促進了EGF誘導(dǎo)的mTORC1激活。

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9.RNF152和USP4通過調(diào)控Rheb的泛素化調(diào)控細胞自噬、細胞增殖和細胞大小

????????mTORC1是自噬的負性調(diào)節(jié)因子，作者研究了RNF152抑制和USP4促進誘導(dǎo)的mTORC1激活是否影響細胞自噬。數(shù)據(jù)顯示RNF152的缺失導(dǎo)致LC3II水平的降低。此外，在RNF152缺失的MEFs中自噬受到抑制，而在HEK293T細胞中過表達RNF152可以促進自噬。研究表明RNF152介導(dǎo)的Rheb泛素化可調(diào)控細胞自噬。

????????作者還研究了USP4是否參與調(diào)節(jié)mTORC1介導(dǎo)的細胞功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP4的敲低或敲除會導(dǎo)致LC3II水平的急劇增加，而Vialinin A處理降低了p62和磷酸化ULK1的水平。此外，USP4-WT的表達抑制了細胞自噬。

????????由于mTORC1還是細胞增殖和細胞大小的主要調(diào)節(jié)因子，作者研究了USP4在調(diào)控細胞增殖和細胞大小中的生物學(xué)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP4的缺失或Vialinin A的處理抑制了細胞增殖，而Rheb-K8R的表達促進了細胞增殖，并消除了siUSP4和Vialinin A的抑制作用。另外，USP4敲除或Vialinin A處理使得細胞變小。

?研究結(jié)論：USP4是mTORC1介導(dǎo)細胞活動的正調(diào)控因子，包括控制細胞自噬、細胞增殖和細胞大小，而RNF152為負調(diào)控因子。

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10.RNF152和USP4在體內(nèi)以mTORC1依賴的方式調(diào)控腫瘤生長??? ??

????????接著作者研究了RNF152和USP4是否參與mTORC1介導(dǎo)的體內(nèi)腫瘤發(fā)生。數(shù)據(jù)顯示，RNF152缺失的SW620細胞表現(xiàn)出很強的腫瘤形成能力，并且生長速度很快。p-S6的WB結(jié)果顯示RNF152的敲除導(dǎo)致腫瘤中mTORC1的激活。同時，USP4的敲除導(dǎo)致腫瘤變小，且p-S6的表達水平降低，而Rheb-K8R的表達消除了這一效應(yīng)。

????????作者還構(gòu)建了USP4基因敲除小鼠，并利用小鼠的結(jié)直腸腫瘤模型研究了USP4在結(jié)直腸癌中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，USP4-/-小鼠產(chǎn)生的腫瘤集落較少，而且野生型小鼠的體重減輕多于USP4-/-小鼠。實驗顯示，在USP4-/-小鼠的腫瘤樣本中，mTORC1活性下降。另外，作者通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫分析了RNF152的表達水平，發(fā)現(xiàn)RNF152在各種類型癌癥中表達下調(diào)，包括結(jié)腸癌、肺癌、腎癌和肝癌。

研究結(jié)論：RNF152和USP4通過調(diào)控mTORC1的激活在腫瘤生長中發(fā)揮重要作用。

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結(jié)論與討論

????????研究表明,RNF152和USP4構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制著Rheb-GDP(失活狀態(tài))和Rheb-GTP(激活狀態(tài))之間的轉(zhuǎn)換，從而嚴重影響mTORC1的激活、自噬、細胞增殖和腫瘤發(fā)生。此外，USP4基因缺失或USP4抑制劑Vialinin A的治療可抑制結(jié)直腸癌的生長，暗示了USP4抑制劑在未來癌癥治療中的潛在臨床應(yīng)用?？傊髡叩难芯拷沂玖薘heb活性的一種調(diào)控機制，通過該機制,Rheb泛素化的翻譯后修飾決定mTORC1激活和隨后的腫瘤發(fā)生。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0120-9