【引語(yǔ)】

? ? 產(chǎn)毒微生物廣泛存在于人們的生活環(huán)境和食物中，對(duì)動(dòng)物和人類健康構(gòu)成極大威脅。A.flavus和A.parasiticus是主要產(chǎn)生黃曲霉毒素的曲霉菌屬。這些能產(chǎn)生黃曲霉毒素的物種被稱為黃曲霉毒素真菌。在黃曲霉毒素真菌中，A.flavus在土壤中約占94%。黃曲霉不僅存在于田間土壤等環(huán)境中，而且廣泛存在于花生、玉米、水稻、小麥、棉花等農(nóng)產(chǎn)品中。黃曲霉毒素是一類真菌的次生代謝產(chǎn)物，被稱為危害最大、污染最廣的霉菌毒素。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將黃曲霉毒素B1定義為I類致癌物。其對(duì)人類肝癌新發(fā)病例的致病率高達(dá)28.2%。根據(jù)FAO數(shù)據(jù)，每年約有25%的谷物被霉菌毒素污染。鑒于黃曲霉毒素真菌的威脅，發(fā)展高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

? ? 提高檢測(cè)靈敏度是分析化學(xué)領(lǐng)域永恒的主題。以更高的靈敏度檢測(cè)有毒微生物，意味著可以更早發(fā)現(xiàn)污染風(fēng)險(xiǎn)，為早期防控提供科學(xué)依據(jù)。近年來(lái)，納米抗體在分析化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，已有報(bào)道用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的小分子污染物。納米抗體具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。除了以上報(bào)道優(yōu)勢(shì)，納米抗體能否提高大分子檢測(cè)領(lǐng)域的檢測(cè)靈敏度？如何提高檢測(cè)靈敏度？到目前為止，還沒有答案。紙基免疫傳感器，尤其是免疫層析試紙條技術(shù)是一種快速定量的方法，已廣泛應(yīng)用于食品和農(nóng)業(yè)中有害物質(zhì)的檢測(cè)。迄今為止，關(guān)于如何通過(guò)納米抗體提高TRFIA對(duì)大分子危害物的檢測(cè)靈敏度，幾乎沒有相關(guān)研究。

? ??本研究以產(chǎn)黃曲霉毒素真菌為例，以紙基免疫傳感器為檢測(cè)技術(shù)，研究如何利用納米抗體提高檢測(cè)靈敏度。基于先前獲得的可用于鑒定黃曲霉毒素黃曲霉和寄生曲霉生物標(biāo)志物的特異性納米抗體和多克隆抗體，開發(fā)了一種高靈敏度的紙基夾心免疫傳感器，通過(guò)將納米抗體代替IgG抗體進(jìn)行固定化，為其他大分子危害的高靈敏檢測(cè)提供了新途徑。

【成果簡(jiǎn)介】??

1、Eu/Tb (III)納米微球與抗體偶聯(lián)的優(yōu)化和表征

? ? Eu/Tb(III)微球的-COOH被EDC激活，與抗體形成酰胺鍵完成連接反應(yīng)。當(dāng)加入20 μL EDC溶液時(shí)，Eu/Tb (III)?微球顯示出高穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度?？贵w劑量對(duì)共軛熒光有很大影響。數(shù)據(jù)顯示，60 μg PO8-VHH和多克隆抗體在偶聯(lián)反應(yīng)中均產(chǎn)生最高的偶聯(lián)物熒光（圖1a）。FTIR用于分析Eu/Tb (III)微球（圖1b）。已知蛋白質(zhì)酰胺結(jié)構(gòu)FTIR在1600-1700 cm?1具有特征。1602 cm?1處的伸縮振動(dòng)吸收表明蛋白酰胺結(jié)構(gòu)成功裝飾在Eu/Tb (III)微球表面。Eu/Tb (III)免疫探針的形態(tài)通過(guò)TEM表征（圖?1c）。微粒偶聯(lián)的探針呈規(guī)則圓形，粒子間大小比較均勻。直徑為196 nm，均勻分散在溶液中。這種抗體與Eu/Tb(III)微球偶聯(lián)的過(guò)程不應(yīng)引起微球熒光強(qiáng)度衰減過(guò)大，否則會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。在500 nm~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描Eu/Tb(III)微球的熒光強(qiáng)度（圖1d）。結(jié)果表明抗體無(wú)熒光信號(hào)峰，PO8-VHH探針和多克隆抗體探針的熒光強(qiáng)度與裸微球接近，表明偶聯(lián)探針可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

2、紙基夾心免疫傳感器兩種模式的比較

? ? ?對(duì)于兩種抗體（納米抗體和多克隆抗體），理論上存在兩種夾心模式，如圖2所示，（1）膜上的納米抗體-生物標(biāo)志物-Eu/Tb標(biāo)記的多克隆抗體（III）粒子模式和（2）膜上的多克隆抗體-生物標(biāo)志物-Eu/Tb (III)粒子模式標(biāo)記的納米抗體。為了描述和比較這兩種模式，我們假設(shè)固定在膜上的納米抗體分子數(shù)為A（因此，理論上固定在膜上的IgG抗體分子數(shù)應(yīng)為0.1*A，因?yàn)榧{米抗體大小約為0.1倍的IgG抗體），每個(gè)生物標(biāo)志物分子上有X個(gè)不同的抗原表位（即總共可以結(jié)合X個(gè)多克隆抗體分子），多克隆抗體中針對(duì)該生物標(biāo)志物的抗體的比例為Y，每個(gè)標(biāo)記的抗體分子（即納米抗體或多克隆抗體）的熒光信號(hào)值為B，說(shuō)明所有反應(yīng)中的生物標(biāo)志物數(shù)量足夠，理論上所有反應(yīng)均已完成。

? ??? 根據(jù)上述，在模式(1)中，將納米抗體(編號(hào)為A)固定在膜上，可以捕獲A個(gè)生物標(biāo)志物，進(jìn)而可以捕獲標(biāo)記的多克隆抗體為A*(X-1)。因此，最終該模式下檢測(cè)信號(hào)Fmax-1的最大值為A*(X-1)，如式(1)所示。

Fmax-1=A*(X-1), in which X is ≥2? ? ? ? ? ? ? ????(1)

? ?? 在模式（2）中，將多克隆抗體（編號(hào)為A）固定在膜上，可以捕獲（0.1*A*Y）*2個(gè)生物標(biāo)志物分子，然后(0.1*A*Y)*2個(gè)標(biāo)記的納米抗體可以被捕獲。因此，最終該模式下檢測(cè)信號(hào)Fmax-2的最大值為0.2*A*Y，如式(2)所示。

Fmax-2=0.2*A*Y, in which Y is much less than 1%??? ? ? ?(2)

? ? 所以，理論上只需要比較哪個(gè)最大值更大，就應(yīng)該選擇信號(hào)更大的模式進(jìn)行進(jìn)一步的研究。比較Fmax-1和Fmax-2，結(jié)果如式(3)所示。

Fmax-1 / Fmax-2 = [A*(X-1)] ÷ [0?2*A*Y] ≥ 500??????????? (3)

? ? 根據(jù)式（3），模式（1）下檢測(cè)信號(hào)的最大值至少是模式（2）下的500倍。在比較兩種模式的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)相同濃度的靶標(biāo)加入反應(yīng)孔時(shí)，模式（1）中的檢測(cè)信號(hào)很容易觀察到，但我們從未在模式（2）中觀察到任何檢測(cè)信號(hào)。模式(2)的檢出限接近0.1 mg/mL，恰好驗(yàn)證了上述理論分析的正確性。因此，本文選擇模式（1）進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3、紙基夾心免疫傳感器的構(gòu)建與組裝

? ?? 根據(jù)以上結(jié)果，選擇納米抗體固定在膜上的方式進(jìn)一步構(gòu)建免疫傳感器。將濃度為0.25 mg/mL的納米抗體（T線）和山羊抗兔IgG（C線）以0.6 μL/cm的速率噴灑在膜上。NC膜（Whatman FF120）和樣品墊（Fushion 3）依次固定在塑料底板上。將組裝好的條帶用切條機(jī)切割成寬度為4mm的標(biāo)準(zhǔn)條帶。準(zhǔn)備好的測(cè)試條在4°C下至少可穩(wěn)定保存180天。反應(yīng)緩沖液為1%蔗糖+2.5% Tween-20+0.5% PVP K30，PBS緩沖液（0.01 M，pH 7.4）。將免疫探針用反應(yīng)緩沖液稀釋100倍，將免疫探針/樣品（1:9）加入微孔中進(jìn)行免疫層析。因此，每批免疫探針可用于5000個(gè)樣本。

4、紙基夾心免疫傳感器TRFIA的優(yōu)化

? ? ?為了保證反應(yīng)速率的一致性，一般選擇抗原抗體反應(yīng)的最佳溫度為37℃。固定化納米抗體完全捕獲抗原需要一定的時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)中，在40min內(nèi)每5min記錄一次T線熒光強(qiáng)度與C線熒光強(qiáng)度的比值（FIT/FIC）（圖3a）。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)IT/FIC信號(hào)逐漸減弱。15 min后熒光強(qiáng)度比值趨于穩(wěn)定，說(shuō)明最佳反應(yīng)時(shí)間為15 min。將黃曲霉毒素真菌菌絲體溶液（生物標(biāo)志物參考）稀釋成不同濃度（0.01、0.1、1、10、100、1000 μg/mL），并通過(guò)同一批紙基免疫傳感器進(jìn)行檢測(cè)（圖3b）。以黃曲霉菌絲體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以FIT/FIC為縱坐標(biāo)繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖3c所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.46251–1.17302/(1+x/0.06639)0.57226)，R2=0.9998。標(biāo)準(zhǔn)曲線檢出限為0.035 μg/mL，肉眼目測(cè)檢出限為0.1 μg/mL。

5、方法評(píng)價(jià)

? ? 在空白花生樣品和液體培養(yǎng)基中進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)做基質(zhì)效應(yīng)研究。紙基免疫傳感器對(duì)花生和液體培養(yǎng)基中黃曲霉毒素真菌的檢測(cè)限分別為0.085 μg/mL和0.23 μg/mL（圖4）。該結(jié)果表明濃度為4 mg/mL的花生基質(zhì)和液態(tài)培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)的影響很小。檢測(cè)范圍分別為0.085–323.56 μg/mL和0.23–327.55 μg/mL。該靈敏度滿足了黃曲霉毒素真菌監(jiān)測(cè)在食品和環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用。

? ? ?計(jì)算回收率和組內(nèi)、組間變異系數(shù)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。表1顯示平均回收率為77.02~91.61%，回收率較好，與ELISA法相當(dāng)。日內(nèi)變異系數(shù)為8.66~11.69%，日間變異系數(shù)為7.93~12.57%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的TRFIA方法的回收率、精密度和重現(xiàn)性均在可接受的范圍內(nèi)。采用TRFIA和已報(bào)道的ELISA對(duì)8個(gè)盲樣進(jìn)行檢測(cè)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致（表2），說(shuō)明TRFIA方法可靠，檢測(cè)時(shí)間短于ELISA方法。

6、重要應(yīng)用

? ?? 通過(guò)花生接種實(shí)驗(yàn)，利用建立的檢測(cè)方法揭示黃曲霉產(chǎn)毒真菌和黃曲霉毒素的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，接種后第2天即可檢出產(chǎn)黃曲霉毒素的真菌，第4天可初步檢出黃曲霉毒素（圖5a）。從第8天開始，黃曲霉產(chǎn)毒真菌和黃曲霉毒素的檢出量急劇上升，這與產(chǎn)黃曲霉產(chǎn)毒真菌的繁殖加速有關(guān)。因此，該方法可以在黃曲霉毒素產(chǎn)生之前檢測(cè)黃曲霉毒素真菌，從而通過(guò)黃曲霉毒素真菌的早期檢測(cè)減少黃曲霉毒素污染。

? ? 土壤是黃曲霉的主要棲息地，也是花生中黃曲霉毒素真菌的主要來(lái)源。花生果實(shí)被黃曲霉毒素污染的主要原因是直接接觸土壤中的黃曲霉毒素。本研究從中國(guó)五個(gè)花生產(chǎn)區(qū)采集了土壤樣品，并通過(guò)紙基夾心免疫傳感器評(píng)估了田間黃曲霉毒素真菌污染的豐度。如圖（圖5b）所示，HNAH的黃曲霉產(chǎn)毒真菌最高，LNFX最低，花生產(chǎn)區(qū)黃曲霉豐度差異顯著。該檢測(cè)方法揭示了環(huán)境中黃曲霉毒素真菌的早期風(fēng)險(xiǎn)，在黃曲霉毒素真菌污染程度高的地區(qū)應(yīng)立即采取現(xiàn)場(chǎng)防控措施，避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

【小結(jié)】

? ? 以黃曲霉毒素真菌為例，本研究報(bào)告了一種紙基夾心免疫傳感器提高大分子檢測(cè)靈敏度的方法。當(dāng)納米抗體固定在NC膜上時(shí)，其靈敏度至少是IgG固定模式的500倍，樣品檢測(cè)的反應(yīng)時(shí)間為15min。紙基免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素真菌的檢出限為0.035 μg/mL，在花生和液體培養(yǎng)基中的檢出范圍分別為0.085–323.56 μg/mL和0.23–327.55 μg/mL。該模型還表現(xiàn)出令人滿意的回收率(77.02%~91.61%)、選擇性和重現(xiàn)性。兩個(gè)重要的應(yīng)用案例成功證明了花生和花生根際土壤中黃曲霉毒素真菌的豐度，表明該方法對(duì)實(shí)際樣品中的黃曲霉毒素真菌具有良好的適用性?；邳S曲霉毒素真菌固定化納米抗體的時(shí)間分辨紙基夾心免疫傳感器的成功建立，為檢測(cè)大分子有害物質(zhì)高靈敏度免疫傳感器的開發(fā)提供了新途徑。

【原文出處】

Yan, H., Fu, J., Tang, X., Wang, D., Zhang, Q., Li, P. Sensitivity enhancement of paper-based sandwich immunosensor via nanobody immobilization instead of IgG antibody, taking aflatoxingenetic fungi as an analyte example. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022, 373.

指導(dǎo)老師：王戰(zhàn)輝

文章轉(zhuǎn)載自：抗體故事微信公眾號(hào)