做基因敲除大家首先想到的是Crispr/Cas9技術(shù)，這也是目前最為流行和應(yīng)用廣泛的基因編輯技術(shù)。雖然Crispr/Cas9編輯效率高，能精準(zhǔn)定位目標(biāo)區(qū)域，但是它脫靶率不容忽視。在細(xì)胞水平做敲除，我們需要經(jīng)過長(zhǎng)期的單克隆篩選才能最終得到完全敲除目的基因的細(xì)胞系，而在動(dòng)物體內(nèi)沒辦法做到這樣的篩選過程，因此基本很難通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Cas9和gRNA來完全敲除組織或細(xì)胞中的目的基因，一般整體上只能達(dá)到敲低的效果。

那么想利用病毒載體做體內(nèi)敲除有沒有其他方法呢？答案是肯定的。Cre-loxp系統(tǒng)也是一種基因編輯技術(shù)，可以用于細(xì)胞或動(dòng)物水平的特異性刪除或插入基因。Cre-loxp系統(tǒng)由重組酶Cre和它的特異性識(shí)別位點(diǎn)loxp序列組成，其中l(wèi)oxp序列具有方向性，可以利用它的方向性來達(dá)到不同的編輯目的，具體可以查看咱們往期的文章“Cre-loxP重組酶系統(tǒng)應(yīng)用全攻略”。我們今天主要來看下它的敲除方法，當(dāng)目的序列兩端loxp位點(diǎn)的方向是同向時(shí)，cre酶識(shí)別位點(diǎn)并切割后，即可刪除兩個(gè)loxp位點(diǎn)之間序列（圖1），從而達(dá)到敲除的目的。

圖1 cre-loxp系統(tǒng)敲除目的序列示意圖

??了解cre-loxp系統(tǒng)的敲除策略后，如何結(jié)合病毒應(yīng)用到體內(nèi)呢？首要的條件是需要獲得flox小鼠（或其他動(dòng)物），即小鼠全身或特定組織或細(xì)胞中的目的基因兩端帶有同向的loxp位點(diǎn)，可表示為A基因flox/flox小鼠；然后即可通過構(gòu)建表達(dá)cre的腺相關(guān)病毒（AAV-Cre），同時(shí)可以帶上針對(duì)特定組織或細(xì)胞的血清型和啟動(dòng)子，來達(dá)到更為高效準(zhǔn)確的cre表達(dá)，從而進(jìn)行基因敲除（圖2）。AAV-cre結(jié)合flox小鼠可以快速實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)基因敲除的目的。

圖2 用cre病毒和loxp轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因敲除

? 除此之外，運(yùn)用cre-loxp還可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間特異性的重組調(diào)控。在Cre酶的C端融合ER（人雌激素受體）的配體結(jié)構(gòu)域LBD，形成Cre-ER融合蛋白，并定位于胞漿中。只有與雌激素結(jié)合后，cre酶才能被釋放出來，入核發(fā)揮功能(圖3)。為避免內(nèi)源性雌激素的干擾，對(duì)LBD做了改造，使得Cre-ER只能結(jié)合人工合成的雌激素（如Tamoxifen等），來誘導(dǎo)Cre的解離，目前有Cre-ERT和Cre-ERT2兩種。Cre-ERT2的敏感性更高。因此，我們可以通過控制Tamoxifen的處理時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因重組的時(shí)間特異性調(diào)控。構(gòu)建表達(dá)CreERT或CreERT2的AAV載體，可以配合flox小鼠使用Tamoxifen來做條件性敲除。

圖3 他莫昔芬 (Tam) 誘導(dǎo)的雌激素受體系統(tǒng)與 Cre (CreER) 融合[1]

????????Cre-loxp系統(tǒng)病毒依賴的基因敲除方式相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因小鼠更為靈活，且區(qū)域特異性更強(qiáng)，得益于AAV的特異性血清型和啟動(dòng)子的優(yōu)勢(shì)；另外極大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，而轉(zhuǎn)基因小鼠的建立過程非常耗時(shí)，且價(jià)格也比較昂貴。因此，使用AAV-cre病毒配合flox動(dòng)物做體內(nèi)基因敲除是目前的熱門之選。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147.