轉(zhuǎn)染 ，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)，是我們完成項目的最基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為3種途徑：物理介導(dǎo)（電穿孔法、顯微注射、基因槍）、化學(xué)介導(dǎo)、生物介導(dǎo)（病毒介導(dǎo)）。

細(xì)胞電轉(zhuǎn)染

一、?實驗原理：
細(xì)胞電轉(zhuǎn)染（電轉(zhuǎn)），也叫細(xì)胞電穿孔，是用短暫的高場強電脈沖處理細(xì)胞，沿細(xì)胞膜的電壓差異會讓電流可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促，從而使外源大分子物質(zhì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、一些小分子等進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部。

二、?影響因素

1.細(xì)胞狀態(tài)

為保證電轉(zhuǎn)后細(xì)胞的存活率，最好選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。因為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分裂更為旺盛，細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的致密性與穩(wěn)定期的細(xì)胞相比較差，因此在電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力更強，從而提高電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞存活率。同時，處于有絲分裂期的細(xì)胞會更容易接受外源物質(zhì)，有利于提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

2.電轉(zhuǎn)參數(shù)

選擇合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)對于電轉(zhuǎn)實驗非常重要，電轉(zhuǎn)參數(shù)包括電壓（500v-1900v）、脈沖（10 ms-45 ms）、次數(shù)（1-5），一般都分布在這一區(qū)間內(nèi)。參數(shù)過低，不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔，外援物質(zhì)無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的；參數(shù)過高，細(xì)胞膜發(fā)生不可逆破碎，細(xì)胞死亡率增加，轉(zhuǎn)染失敗，因此在電轉(zhuǎn)染實驗中合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)尤為重要。不同細(xì)胞的形態(tài)、特性及耐受度等都不同，實驗前需要我們先通過電轉(zhuǎn)預(yù)實驗來摸索出最合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，而后再進(jìn)行正式試驗。

3.其他電擊會對細(xì)胞造成一定程度的傷害，而具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)緩沖液可以將電擊對細(xì)胞的損傷降到最低，從而降低轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的死亡率，提高轉(zhuǎn)染效率。

三、?電轉(zhuǎn)預(yù)實驗
實驗?zāi)康模?/strong>在開展正式實驗前摸索出最合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)。

實驗流程

1.實驗前準(zhǔn)備：電轉(zhuǎn)杯、電轉(zhuǎn)槍、電轉(zhuǎn)Tip頭（無菌）；處于對數(shù)生長期的細(xì)胞（細(xì)胞狀態(tài)良好，至少維持合適密度生長2代，未發(fā)生過匯合）；

2.設(shè)置若干個實驗組，貼壁細(xì)胞建議1×105個/組、懸浮細(xì)胞建議2×105個/組；

以貼壁細(xì)胞為例：棄去培養(yǎng)上清，用PBS輕柔沖洗細(xì)胞，抽凈PBS，加胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落后加完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔的吹打細(xì)胞懸液，盡量形成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，取細(xì)胞與1.5 EP管內(nèi)，離心，PBS清洗一遍。加入帶熒光指示的質(zhì)粒，用R Buffer重懸，盡量避免產(chǎn)生氣泡。

3. 準(zhǔn)備一塊24孔板，往各孔中各加入完全培養(yǎng)基；向電轉(zhuǎn)杯里加入E Buffer。

4. 使用電轉(zhuǎn)Tip頭，開始電轉(zhuǎn)，先進(jìn)行電壓的摸索，即固定脈寬及次數(shù)。電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞懸液打入事先準(zhǔn)備好的24孔板內(nèi)吹勻，24h 后觀察熒光。

5. 選擇熒光最好的一組，來進(jìn)行脈寬及次數(shù)的摸索，24h 后觀察熒光。

6. 綜合選擇熒光最佳的一組參數(shù)作為預(yù)實驗參數(shù)。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因敲除

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細(xì)胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 干細(xì)胞/原代細(xì)胞 培養(yǎng)試劑盒?

標(biāo)簽：