前言

齲齒（蛀牙）是最普遍的口腔疾病，嚴重危害人類公共健康，治療費用昂貴。齲齒是細菌生物膜引起的常見疾病。目前臨床防治藥物往往會對口腔微生物多樣性和正常組織產(chǎn)生不良影響，主要原因是藥物的生物膜靶向性較差。因此，開發(fā)高效破壞致齲細菌生物膜的抗菌劑對齲齒的防治尤為迫切和重要。

近日，湖南師范大學工程實驗室張鵬博士后、劉中華教授和南開大學余志林研究員為共同通訊作者，在 ?期刊（IF:11.556）發(fā)表了題為“Dual-sensitive antibacterial peptide nanoparticles prevent dental caries”的研究論文，報道了一種pH和脂質(zhì)雙敏感性抗菌肽納米粒子pHly-1 NPs用于齲齒的防治。

研究結(jié)果

1、?pHly-1依賴于pH和脂質(zhì)進行構(gòu)象轉(zhuǎn)變

首先通過氨基酸替換策略，選擇性的引入組氨酸作為pH敏感元件、調(diào)整多肽的電荷以及疏水性，設計pHly-1肽，隨后對pHly-1的電位、形態(tài)和二級結(jié)構(gòu)進行了表征。在正常生理條件下，pHly-1采用β-折疊構(gòu)象。在酸性環(huán)境下，pHly-1呈無規(guī)則卷曲構(gòu)象，當與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合時，pHly-1肽的構(gòu)象由無規(guī)則卷曲構(gòu)象變換為α-螺旋。多肽的TEM形貌表明，在酸性條件下多肽為大小約40 nm的球形顆粒，而在中性條件下則為長度約400 nm的纖維。

圖1｜pHly-1設計及其pH或脂質(zhì)響應構(gòu)象

2、pHly-1顯示pH和脂質(zhì)雙敏感的抗菌活性

變形鏈球菌UA159（）的最低抑制濃度（MICs）檢測和溶血實驗測定結(jié)果顯示，pHly-1 NPs抗菌活性高，且溶血活性?。▓D2A-B）。在pH 5.5和7.0時，pHly-1 NPs 的MIC值分別為5.5 μM和大于44 μM。殺菌動力學表明，pHly-1 NPs殺菌迅速，且具有pH依賴性，效果優(yōu)于CHX（口服抗菌治療金標準）（圖2C-D）。

表明了pHly-1是一種pH敏感的抗菌肽，在酸性條件下具有強而快速的殺菌活性。其發(fā)揮雙敏感的潛在機制如圖2E所示：在酸性pH環(huán)境下，當pHly-1與細菌膜表面結(jié)合時，構(gòu)象由無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋，導致膜破壞從而表現(xiàn)出較強的抗菌活性。相反，在中性環(huán)境下，pHly-1呈β-折疊構(gòu)象，彼此間通過多種弱相互作用力而發(fā)生堆積，限制了多肽對細菌細胞膜的作用，因此抗菌活性較低。

圖2｜pHly-1抗菌活性的機制

3、pHly-1 NPs抗菌活性的機理分析

直接破壞細菌膜是大多數(shù)抗菌肽殺滅細菌最常見的機制。該研究，通過SEM細菌形態(tài)觀察和熒光雙染研究，證實pHly-1 NPs在pH4.5酸性條件下具有破壞細菌膜的作用，表現(xiàn)出殺菌作用（圖3A-B）。轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進一步顯示，pHly-1 NPs處理后，引起195個基因差異表達（DEGs）。功能富集分析顯示，主要涉及蛋白質(zhì)折疊、細胞程序性死亡、細胞溶解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等與在細菌的生存和生長相關條目（圖3C）。

此外，pHly-1 NPs處理導致了細胞溶解調(diào)控基因的表達增加，糖代謝、核酸代謝和DNA復制的基因表達降低（圖3D）。除了破壞細菌膜外，與抗菌活性和群體感應相關基因表達下調(diào)，群體感應相關基因基因與細菌生物膜發(fā)育過程中細菌增殖和群體行為調(diào)節(jié)有關（圖3D）。該結(jié)果也為解釋了pHly-1 NPs抑制細菌生物膜形成和發(fā)展奠定了一定基礎。

圖3｜不同pH條件下，pHly-1 NPs或CHX處理細菌后的顯微研究、熒光染色和轉(zhuǎn)錄組分析

4、pHly-1 NPs體外抑制生物膜的形成和發(fā)展

該研究首先測定了pHly-1 NPs對細菌粘附的影響，實驗表明其能抑制了生物膜形成初期的細菌附著。為了進一步評估pHly-1 NPs對預形成生物膜發(fā)展的抑制效果，首先讓在載玻片上逐漸形成生物膜，12小時后，用55 μM pHly-1 NPs或CHX，在不同的pH下，處理生物膜10 min，每天一次共計處理3次。隨后采用SEM和共聚焦顯微鏡對生物膜進行成像，圖A中藍色箭頭以及圖B中的綠色熒光代表著，而紅色箭頭以及紅色熒光則代表著形成的EPS基質(zhì)。

實驗表明在pH 4.5下，pHly-1 NPs處理組中的生物膜團簇、細菌數(shù)量和EPS基質(zhì)密度顯著低于對照組（圖4A-B）。然而，在對照組、pH 7 條件下的pHly-1 NPs和CHX處理組之間沒有觀察到顯著變化（圖4A-B）。以上數(shù)據(jù)表明，pHly-1 NPs可能以pH依賴性的方式抑制生物膜的形成和發(fā)展。

圖4｜體外酸性條件下pHly-1 NPs對細菌生物膜形成和發(fā)展的抑制作用

5、pHly-1 NPs體內(nèi)和體外的齲齒抑制作用

基于唾液包被的羥基磷灰石(sHA)的生物膜形成實驗，作者首先觀察到，pHly-1 NPs處理顯著減少了sHA表面細菌生物膜的數(shù)量和大小，將形成的生物膜超聲、勻漿，利用CFU計數(shù)法統(tǒng)計各處理組細菌的活力，表明pHly-1 NPs和CHX均能顯著抑制生物膜的形成與發(fā)展（圖5A-B）。

隨后收集患有嚴重齲齒兒童的牙菌斑生物膜樣本，分離變形鏈球菌，建立生物膜模型，進一步測試pHly-1 NPs對齲齒生物膜的抑制效果。實驗表明在pHly-1 NPs處理組中對形成的細菌生物膜網(wǎng)絡具有顯著的抑制作用（圖5C-D）。上述實驗表明了在酸性條件下，pHly-1 NPs顯著抑制了體外生物膜的形成與發(fā)展。

圖5｜pHly-1 NPs體外的齲齒抑制作用

作者基于變形鏈球菌感染幼鼠牙齒的大鼠模型的體外實驗，發(fā)現(xiàn)pHly-1 NPs治療對初始、中度和重度病變的均能有效緩解。但CHX治療僅緩解嚴重的病變，對于初始和中度病變的治療效果顯著低于pHly-1 NPs，說明pHly-1 NPs的治療效果優(yōu)于CHX，并且對大鼠具有良好的生物安全性（圖6）。同時，細胞和類器官等毒性實驗也證實了，pHly-1 NPs對胃組織毒性較低，有效預防已報道的齲齒防治納米顆粒對胃組織造成的潛在損傷。

圖6｜pHly-1 NPs體內(nèi)的齲齒抑制作用

6、pHly-1 NPs對口腔菌群及周圍組織的不良影響分析

為了評估pHly-1 NPs和CHX應用于漱口水的臨床安全性，將0.2 %的pHly-1 NPs或CHX處理后的小鼠唾液進行微生物組分析。pHly-1 NPs對門水平和屬水平的菌群組成并無影響（圖7A-C），與對照組結(jié)果更為相似（圖7D)，且不改變口腔微生物的多樣性（圖7E-F），表明pHly-1 NPs沒有破壞微生物群的生態(tài)平衡。此外，H&E染色顯示pHly-1 NPs對小鼠牙齦、腭和胃組織沒有明顯的有害影響（圖7G），不良反應僅發(fā)生在CHX治療組。

圖7｜pHly-1 NPs對口腔菌群及周圍組織的不良影響分析

研究結(jié)論