前言

高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的優(yōu)勢在于可以深度解析組織微環(huán)境中各個細胞類型的分子表達圖譜特征，非常適用于疾病的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)課題設(shè)計中。歐易生物協(xié)助發(fā)表了多篇如肺部纖維化、肝損傷等典型的疾病vs 對照類型的相關(guān)單細胞客戶文章。

今天為大家解讀的客戶文章也是類似課題設(shè)計，基于高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序解析人動脈夾層中免疫微環(huán)境特征。該篇文章是由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院發(fā)表在《Frontiers in Cardiovascular Medicine》的相關(guān)研究，劉軼凡老師是本篇文章的第一作者，姜寶紅教授、董智慧教授和符偉國教授為本篇文章的通訊作者。

歐易生物協(xié)助完成本篇文章的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析工作，并特別致謝了歐易生物巴永兵在分析中提供的幫助。

材料：實驗組：3例急性Stanford A 型患者主動脈夾層組織；對照組：2例心臟移植患者主動脈夾層組織

期刊：Frontiers in Cardiovascular Medicine

發(fā)表時間：2022年3月

運用歐易技術(shù)方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

研究內(nèi)容解析

主動脈夾層（AD）是一種危及生命的心血管急癥，其特征是中膜破壞和主動脈壁分離。主動脈炎癥是AD的主要特征之一。中膜和外膜浸潤的免疫細胞可引起氧化應(yīng)激增加，炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，從而促進血管平滑肌細胞（VSMC）凋亡和主動脈重構(gòu)，在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

然而，這些免疫細胞內(nèi)的細胞異質(zhì)性尚未明確。本研究期望通過單細胞測序（scRNA-seq）技術(shù)解析主動脈夾層中免疫細胞分子圖譜的異質(zhì)性，并進一步探索AD的免疫機制和確定新的治療靶點。

研究內(nèi)容解析

為了研究主動脈的炎癥，作者使用白細胞共同抗原（CD45）對免疫細胞進行分選后，進行了10x Genomics scRNA-seq。隨后比較了AD組和正常主動脈中免疫細胞的單細胞圖譜。結(jié)果顯示，AD組織的炎癥不僅涉及巨噬細胞，還涉及適應(yīng)性免疫細胞，特別是T細胞。AD和正常主動脈組織中主要免疫細胞亞群的比例有顯著差異：巨噬細胞在正常主動脈中所占比例較高，而AD組織中T細胞、B細胞和自然殺傷（NK）細胞的比例均增加。在AD組織中擴增的巨噬細胞主要來源于循環(huán)單核細胞，并表達編碼促炎細胞因子和參與組織修復(fù)的基因。在AD組中，T和NK細胞表現(xiàn)出更強的細胞毒性，其中的Th17樣CD4+T細胞可能參與了AD的發(fā)病機制。細胞通訊分析強調(diào)了巨噬細胞和T細胞之間的受配體數(shù)目增加，功能主要是調(diào)節(jié)T細胞的共刺激。

具體研究內(nèi)容解析

人散發(fā)性升主動脈夾層相關(guān)免疫細胞群的scRNA-Seq分析

作者首先從2例心臟移植患者的非病變升主動脈壁組織，以及3例散發(fā)性A型主動脈夾層患者的升主動脈夾層組織中富集CD45+?細胞，接著針對富集得到的細胞進行scRNA-seq（圖1A）。質(zhì)控后，共納入31,755個免疫細胞用于后續(xù)分析。其中，43.1%的細胞來自AD組織，56.9%的細胞來自正常的非病變升主動脈組織（NA組），這些細胞被聚成16個cluster（圖1B），分組展示結(jié)果表明兩組之間的白細胞分布存在潛在的差異（圖1C）。

基于marker基因，作者共鑒定出5種細胞類型（圖1D）：B細胞（2.6%）；粒細胞（14.3%）；髓系細胞（單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）（59.5%）；T細胞和自然殺傷（NK）細胞（19.4%）；肥大細胞（4.1%）（圖1E、F）。各細胞類型在AD組和NA組之間的占比存在顯著差異（圖1G）：AD組織中粒細胞數(shù)明顯上調(diào)，而髓系細胞的比例則小于NA組，兩組T和NK細胞比例基本相同。AD組B細胞呈上調(diào)趨勢，而NA組中肥大細胞相對較多。然而，這可能是因為這兩種細胞類型本身占較少，所以細胞數(shù)量的小變化會導(dǎo)致更大的百分比變化?？偟膩碚f，該分析證明了一個復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。

圖1 | scRNA-seq分析解析人胸主動脈夾層組織的免疫細胞圖譜

來自外周循環(huán)的巨噬細胞主要通過分泌促炎細胞因子導(dǎo)致AD

將檢測到的18910個髓系細胞進一步分為5個cluster（圖2A），并發(fā)現(xiàn)兩組細胞群分布存在差異（圖2B）。其中，只有cluster2在AD樣本中所占比例較高。5個髓系細胞群都表達了高水平的巨噬細胞/單核細胞marker（CD68、CD163、MRCI、CD14）（圖2C）。cluster4表達樹突狀細胞marker（NRP1，IL3RA），因此被定義為樹突狀細胞（DC）。此外，作者發(fā)現(xiàn)駐留型巨噬細胞的marker基因（F13A1、LYVE1和GAS6）在cluster2中表達最低，表明AD樣本中大多巨噬細胞來自循環(huán)巨噬細胞的增殖，而非來自駐留巨噬細胞（圖2D）。

不同極化狀態(tài)的巨噬細胞在主動脈夾層的發(fā)病機制中起不同的作用。作者發(fā)現(xiàn)，M1/M2的marker基因，如MRC1和CD163在幾乎所有的髓系cluster中都有表達（圖2C），無法明確區(qū)分M1型和M2型巨噬細胞。因此，作者使用已報道的基因集（圖2E）對所有髓系cluster進行M1和M2極化、促炎和抗炎以及增殖評分。發(fā)現(xiàn)并沒有嚴格類似于典型M1/M2極化巨噬細胞的cluster，cluster2中同時高表達M1和M2的marker基因，但同時也獲得了較高的促炎和抗炎評分。

接下來，作者主要針對cluster2髓系細胞進行研究。并發(fā)現(xiàn)cluster2中除了高表達促炎分子編碼基因（CXCL5、CCL20、CXCL1、IL1B和PTGS2），也高表達了參與ECM修復(fù)基因（VCAN、EREG、AREG、TIMP1和FN1）（圖2F）。

對髓系細胞各cluster進行GSVA分析，發(fā)現(xiàn)cluster5富集到與結(jié)締組織發(fā)育和膠原纖維組織相關(guān)的條目，一些編碼膠原蛋白成分的基因也在cluster5中上調(diào)（圖2G）?？紤]到該細胞群可能起源于VSMC，作者繪制了SMC marker基因MYH11和CNN1的表達量小提琴圖（圖2G）。結(jié)果顯示，MYH11和CNN1在5個cluster中均表現(xiàn)出低表達，表明cluster5并非來源于SMCs。

隨后，作者對髓系細胞進行SCENIC分析來探索髓系細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是如何被轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。發(fā)現(xiàn)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員在cluster2中上調(diào)最為顯著，據(jù)報道，該家族是M1巨噬細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以促進炎癥基因表達（圖2H）。XBP1也被報道在調(diào)節(jié)活化巨噬細胞中促炎細胞因子的表達中發(fā)揮重要作用。其他幾個在cluster2中上調(diào)的TFs（如CEBPB、FOSL2和CREM）被發(fā)現(xiàn)在單核細胞向巨噬細胞分化的過程中發(fā)揮作用。總之，SCENIC分析再次表明，cluster2髓系細胞起源于循環(huán)單核細胞。然而，這也表明這群髓系細胞顯示出主要的促炎表型。

圖 2 | ?NA和DA組中巨噬細胞的異質(zhì)性

來自AD組織的T和NK細胞具有更強的細胞毒性

圖 3 | 與正常主動脈組織比較，AD組織中CD4+ T細胞的功能變化

基于NKG7、CD3D、CD4和CD8A的表達，將6,168個NK和T細胞分為NK細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞。然后對每種細胞類型進行無監(jiān)督的重新聚類，CD4+T細胞被重新聚集成6個cluster（圖3A）。在AD和NA樣本中，CD4+T細胞的分布存在顯著差異（圖3B）：cluster1，2，6主要在AD樣本中檢測到，cluster3、4，5則主要存在于NA樣本中。根據(jù)CD4+T各亞型marker的表達來看，cluster6被鑒定為Na?ve T cells（圖3C）。

最后作者比較了兩組之間CD4+T細胞的top差異基因（圖3D）。在AD組中，與cluster1，2，6的上調(diào)一致，top 1差異基因LTB在cluster1中高表達。通常在Na?ve T 細胞中高表達的基因，包括ATM和SELL，在AD組中也表達上調(diào)。在NA組中，這些top 差異基因主要是編碼MTs以及與脂質(zhì)代謝和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因。隨后，通過SCENIC分析，作者發(fā)現(xiàn)ATF3是AD組中表達量最高的TFs之一（圖3E）。據(jù)報道，ATF3可促進Th1分化和Th17細胞中IL-17A的表達。對不同cluster的SCENIC分析顯示，ATF3主要在cluster1中表達（圖3F）。總的來說，這些結(jié)果顯示CD4+T細胞群在AD組與NA組中具有不同的功能。

圖 4 | 基于Monocle的CD4+ T單細胞軌跡分析

為了進一步研究CD4+T細胞在AD中的作用，作者采用擬時序分析模擬了CD4+T細胞的分化軌跡（圖4A）。基于之前的研究結(jié)果，cluster6主要由Na?ve T細胞組成，因此指定state6的分支作為起點（圖4B，C）。與NA組相比，state6包含了更多來自AD組的細胞（圖4D）。這表明在AD組中有更多的Na?ve CD4+T細胞，這與之前的發(fā)現(xiàn)一致。然后，將沿假時間軸有顯著差異表達的基因根據(jù)其表達模式聚類為4個模塊（圖4E）。Na?ve CD4+T細胞的marker，如SELL和CCR7，在模塊3中被鑒定出來。在模塊2中發(fā)現(xiàn)了一些由cluster1產(chǎn)生的炎癥蛋白，包括顆粒酶如GZMA和GZMK以及細胞因子如IL32。此外，在模塊4中鑒定出了編碼MTs的基因，包括MT1E、MT1G、MT1X和MT2A（圖4F）。

隨后檢測了AD組和NA組中沿假時間軸的MT編碼基因的表達（圖4F）。這四個MT編碼基因的表達都沿著假時間軸先升高后降低，表明T細胞激活后細胞鋅濃度短暫增加。而在幾乎整個假時間軸上，NA組的MTs表達水平均高于AD組。這表明NA組MTs的增加更可能是由于正常主動脈ECM中鋅濃度較高，而不是最近T細胞的激活。

B細胞作為主動脈夾層中的抗原提呈細胞

基于marker基因的表達，將832個B細胞定義為濾泡（FO）B細胞（MS4A1）和漿細胞（IGHG1、MZB1和SDC1）（圖5A，B）。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OB細胞中高表達MHCII類分子（HLA-DPB1HLA-DQA1和HLA-DQB1），表明這群B細胞的主要功能可能是抗原呈遞（圖5C）。接下來，作者對B細胞做了組間差異表達基因分析（圖5D），結(jié)果顯示AD組中MHCII類分子的表達顯著升高。而編碼免疫球蛋白的基因在正常主動脈中上調(diào)，負調(diào)控B細胞活化的LAPTM5在AD組中高表達，提示B細胞在AD中的主要作用是抗原遞呈和T細胞的活化。同樣，NA組的漿細胞比例更高（圖5E）。

隨后，作者對B細胞做了SCENIC分析（圖5F）。FOB細胞相比于漿細胞來說，TFsKLF2、IRF4和REL的表達顯著上調(diào)（圖5F）。KLF2基因被發(fā)現(xiàn)與FOB細胞從脾臟流出有關(guān)，并調(diào)節(jié)粘附分子SELL的表達，該分子對淋巴細胞進入外周淋巴結(jié)至關(guān)重要。據(jù)報道，IRF4和REL對B細胞的增殖具有重要作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)AD組相比于NA組來說（圖5F，右），KLF2的表達仍顯著上調(diào)，而AD組中IRF4和REL的表達水平低于NA組，提示AD組中的B細胞可能主要來源于外周循環(huán)。

圖5 | NA和AD樣本之間的B細胞分析

在AD組中，NK/T細胞和巨噬細胞之間的細胞通訊增強

為了進一步研究AD組織中先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)之間的相互調(diào)節(jié)過程，作者進行了細胞通訊分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞內(nèi)部相互作用的配體-受體對最多，這表明旁分泌和自分泌信號在調(diào)節(jié)巨噬細胞功能中都發(fā)揮了重要作用（圖6A、B）。此外，與正常主動脈相比，AD組織中CD4+T、CD8+T、NK與巨噬細胞之間的細胞通訊強度增加（圖6C）。T和NK也會分泌細胞因子來調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，如NK和T細胞中TNF和VEGFβ的分泌均升高，巨噬細胞中相應(yīng)受體的表達增加。這些結(jié)果表明，AD組織中的T細胞可誘導(dǎo)巨噬細胞同時向M1和M2表型分化。

圖6 | 免疫細胞之間的細胞通訊

實驗驗證

圖 7 | 對NA和AD組進行多重免疫熒光檢測，以驗證免疫細胞的比例

作者采用多重免疫熒光來驗證每種免疫細胞（肥大細胞、粒細胞、B細胞、巨噬細胞和T細胞）在對照組和主動脈夾層組織中的占比（圖7）。通過比較兩組免疫細胞的分布，作者發(fā)現(xiàn)AD組織中所有免疫細胞亞群均有擴增，其中粒細胞、T細胞和髓系細胞的擴增最為明顯（圖7B）。在AD組織中，對多重免疫熒光及單細胞兩種結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示各免疫細胞類型的比例較一致（圖7C），而正常主動脈中則結(jié)果相反。這可能是由于多重免疫熒光作為一種半定量方法的局限性，以及患者的個體差異導(dǎo)致的。此外，由于正常主動脈組織中免疫細胞總數(shù)較低，細胞計數(shù)的微小偏差可能導(dǎo)致其百分比計算發(fā)生較大變化。然而，這些細胞比例的不一致應(yīng)該對每種細胞類型的定性特征影響不大。

結(jié)論

本研究在單細胞水平上揭示了人胸主動脈夾層組織的免疫細胞圖譜。并鑒定了一個在AD組織中擴增且具有獨特轉(zhuǎn)錄組的巨噬細胞群，這些巨噬細胞可能通過分泌細胞因子和招募其他免疫細胞，特別是粒細胞和T細胞來導(dǎo)致AD。進一步研究巨噬細胞和T細胞在AD中的作用可能為AD提供新的診斷或治療靶點提供幫助。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解高通量測序、單細胞測序、轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

猜你想看

1、單細胞測序助力解析miR-6077促進肺腺癌順鉑/培美曲塞耐藥機制

2、J. Transl. Med. | 單細胞轉(zhuǎn)錄組助力探究順鉑耐藥相關(guān)的多組學(xué)差異及機器學(xué)習(xí)模型的建立

3、Adv. Sci. | 歐易單細胞測序助力揭示Myf5衍生細胞的異質(zhì)性以及其缺失SRSF2后肌源性命運的改變

4、Front. Med. | 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)閃亮登場~揭曉正常腎臟近端腎小管和腎小球的玄機！

原創(chuàng)聲明：本文由歐易生物(OEBIOTECH)學(xué)術(shù)團隊報道，本文著作權(quán)歸文章作者所有。歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)及分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載。