????????目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過(guò)3'→5'磷酸二酯鍵連接。

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1. 固相亞磷酰胺三脂法合成引物的具體步驟如下

????????1) 用三氯乙酸去除固相載體5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基；

????????2) 將亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；

????????3) 由于無(wú)法保證百分之百的5'-羥基都參與縮合，可能有極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉；

????????4) 在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定。

????????經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過(guò)程中可以監(jiān)控脫下的保護(hù)基團(tuán)DMT的顏色可以初步判定合成效率。

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2. DNA合成粗產(chǎn)物中含有什么雜質(zhì)？

????????主要是合成過(guò)程中產(chǎn)生的少量失敗片段。?

3. 引物純化方式有哪些

????????目前引物常用的純化方式有：C18脫鹽、RPC純化、ePAGE純化、PAGE純化、HPLC純化。

4. 引物純化方式如何選擇？

????????一般采用RPC、ePAGE純化、PAGE、HPLC四種純化方式，在選擇上主要根據(jù)引物的長(zhǎng)度和應(yīng)用方面對(duì)純度的要求而定，表2即從引物長(zhǎng)度的角度總結(jié)了以上每一種純化方法的適用范圍?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇合適的引物純化方式。

5. 合成的引物5'端是否有磷酸化？

????????合成的引物5'端為羥基，沒(méi)有磷酸基團(tuán)。如果需要，可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5'端磷酸化，或者合成時(shí)直接在5'或3'端進(jìn)行磷酸化。

6. 最長(zhǎng)可以合成多長(zhǎng)的引物？

????????引物越長(zhǎng)，出現(xiàn)問(wèn)題的概率就越大。除非有特殊需要，我們建議合成片段長(zhǎng)度不要超過(guò)80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)引物的百分比不會(huì)超過(guò)40%，后續(xù)處理還會(huì)丟失很多，因此最后的產(chǎn)量很低。

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7. 為何長(zhǎng)鏈引物的收費(fèi)比短鏈引物要高？

????????在合成長(zhǎng)鏈引物時(shí)，所需要的試劑比短鏈引物要多，回收值也相對(duì)低一些，尤其是長(zhǎng)度大于90base的引物。由于成本的增加，從而導(dǎo)致價(jià)格升高。

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8. PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆以后測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)與合成序列不相符合，怎么辦？

????????多數(shù)情況是PCR過(guò)程和克隆過(guò)程中引入的錯(cuò)誤。遇到這種情況，可以：

????????1) 重新挑取克隆測(cè)序，會(huì)有找到正確克隆的可能。

????????2) 重新合成引物。

9. 測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

????????引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，每一步的合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來(lái)就越高。在PCR擴(kuò)增后克隆測(cè)序的時(shí)候，為了節(jié)約時(shí)間和提高成功率，建議：

??????1)在檢測(cè)到陽(yáng)性克隆后準(zhǔn)備2~3個(gè)陽(yáng)性克隆子的菌液，盡量送測(cè)2個(gè)或以上克隆，這樣成功率將大大提高，也節(jié)約很多時(shí)間；

??????2)也可以先送測(cè)1個(gè)克隆，其余兩個(gè)克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出現(xiàn)個(gè)別點(diǎn)突變或缺失，立即將余下的兩個(gè)克隆送測(cè)；

??????3）這樣得到正確的序列可能性將非常高，并且可以免去重新PCR、連接、克隆以及篩選的一系列實(shí)驗(yàn)操作，更省去了很多時(shí)間。

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