提到“視黃醛（A醛）”，首先會(huì)想到什么？當(dāng)然是抗老！??！A酸、A醇、A醛、玻色因......，但是，“視黃醛”另一個(gè)作用卻鮮為人知，視黃醛缺乏——糖尿病惡化。

視黃醛（Rald，A醛）是視黃醇轉(zhuǎn)化為視黃酸（RA，A酸）過(guò)程的中間物，屬于維生素A類物質(zhì)，是機(jī)體維持正常生理過(guò)程的必需營(yíng)養(yǎng)素。近年來(lái)，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)Rald可以影響機(jī)體糖脂代謝平衡，此過(guò)程主要由葡萄糖激酶（GCK）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）等酶控制。中國(guó)藥科大學(xué)劉曉東團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)Rald濃度穩(wěn)定對(duì)維持機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)具有重要作用，且2型糖尿?。═2D）患者體內(nèi)常常伴有Rald水平降低現(xiàn)象，但Rald缺乏在T2D中作用的具體機(jī)制卻尚不清晰。

2023年5月6日，中國(guó)藥科大學(xué)劉李/劉曉東和南京第一人民醫(yī)院鄒建軍為共同通訊作者在《Acta Pharmaceutica Sinica B》（IF=14.5）發(fā)表了題為：“Hepatic retinaldehyde deficiency is involved in diabetes deterioration by enhancing PCK1- and G6PC-mediated gluconeogenesis”的研究論文，在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)添加Rald/RA或利用AAV9-RALDH1-shRNA使肝臟中視黃醛脫氫酶1（RALDH1）表達(dá)下降，顯著降低了T2D小鼠的空腹血糖水平，并上調(diào)了Rald表達(dá)，下調(diào)了PCK1和G6PC的表達(dá)，證明了肝臟Rald缺乏與T2D惡化相關(guān)，并且在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠、人原代肝細(xì)胞、油酸（OA）處理的人肝癌細(xì)胞（HepG2）中也證明了這一點(diǎn)。利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接，從機(jī)制上解釋了肝臟Rald缺乏、肝臟糖異生和T2D惡化之間的聯(lián)系，同時(shí)也證明了Rald是T2D潛在治療靶點(diǎn)，為T2D治療提供了新的理論支撐。

劃重點(diǎn)?。?！本研究使用了漢恒生物提供的針對(duì)RALDH1基因沉默的腺相關(guān)病毒（AAV9-RALDH1-shRNA）。

下面，介紹一下具體的研究過(guò)程：

首先，作者對(duì)T2D小鼠體重，采食量，飲水量以及空腹血糖量等生理參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T2D小鼠往往伴隨著肝臟糖異生作用增強(qiáng)和葡萄糖利用受損的情況，并且肝臟Rald表達(dá)量降低RALDH1表達(dá)量升高。而在Rald或Rald+RALDH1抑制劑作用后，Rald表達(dá)量顯著升高，小鼠的糖尿病癥狀得到緩解，表明小鼠肝臟Rald缺乏與T2D惡化相關(guān)。

圖1. 肝臟Rald缺乏導(dǎo)致T2D惡化

為了探究RALDH1表達(dá)量下降是否與T2D惡化相關(guān)，作者利用AAV9-RALDH1-shRNA對(duì)T2D小鼠肝臟RALDH1基因進(jìn)行特異性沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RALDH1基因沉默后，小鼠肝臟Rald基因水平顯著上升，小鼠的糖尿病癥狀得到改善，表明肝臟RALDH1沉默可以增加肝臟Rald水平從而改善肝臟糖異生。

圖2. RALDH1沉默通過(guò)增加肝臟Rald水平緩解肝糖異生

據(jù)報(bào)道，T2D肝臟糖異生占肝臟葡萄糖產(chǎn)量的75%，此過(guò)程主要受GCK、PCK1和G6PC等基因的調(diào)控。作者檢測(cè)T2D小鼠中PCK1、G6PC和GCK表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)呈增加趨勢(shì)，Rald+RALDH1抑制劑作用后PCK1和G6PC表達(dá)量降低，GCK表達(dá)量增加，沉默肝臟RALDH1基因后，與對(duì)照組相比T2D小鼠中PCK1和G6PC表達(dá)水平均下降，GCK蛋白水平未受影響，因此證明PCK1和G6PC表達(dá)量的改變可能是導(dǎo)致肝臟Rald水平變化的原因。

圖3. PCK1和G6PC表達(dá)量變化影響肝臟Rald水平

為了探究正常小鼠Rald缺乏是否影響肝臟糖代謝，作者采用C57BL/6J小鼠并配合高脂飲食，檢測(cè)結(jié)果表明高脂飼養(yǎng)的小鼠體重、空腹血糖和腹腔注射葡萄糖或丙酮酸后的血清中葡萄糖含量上升，Rald表達(dá)量下降，表明小鼠肝臟糖異生作用增強(qiáng)，利用AAV9-RALDH1-shRNA沉默高脂飼養(yǎng)小鼠RALDH1基因后，Rald表達(dá)量顯著升高，相應(yīng)的PCK1和G6PC表達(dá)量下降，小鼠腹腔注射葡萄糖或丙酮酸后的血清中葡萄糖含量相較高脂飼養(yǎng)小鼠有所下降，但是體重不變，說(shuō)明RALDH1沉默減輕高脂飲食小鼠肝臟糖異生。

圖4. RALDH1沉默減輕高脂飲食小鼠肝臟糖異生

大量研究發(fā)現(xiàn)，T2D通常與肝臟脂肪變性有關(guān)，因此作者利用油酸（OA）處理HepG2細(xì)胞探究Rald在肝臟糖異生中的作用。顯微鏡下觀察OA處理的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)肝臟脂肪變性的特征，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴并且伴隨葡萄糖利用受損以及葡萄糖產(chǎn)量增加，G6PC和PCK1表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組。利用siRNA下調(diào)OA處理組RALDH1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rald和Rald+siRALDH1都可以顯著抑制葡萄糖的產(chǎn)生并下調(diào)G6PC和PCK1表達(dá)，但是對(duì)葡萄糖的利用以及對(duì)GCK的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響。之后作者在來(lái)自四個(gè)捐贈(zèng)者的人原代肝細(xì)胞中重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了與HepG2細(xì)胞中一樣的現(xiàn)象，表明Rald通過(guò)抑制OA處理的HepG2細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞中PCK1和G6PC的表達(dá)而改善肝臟糖異生。

圖5. Rald通過(guò)抑制PCK1和G6PC的表達(dá)而改善肝臟糖異生

Rald的化學(xué)結(jié)構(gòu)與RA相似，因此作者猜測(cè)Rald可能通過(guò)影響RA受體下調(diào)PCK1和G6PC的表達(dá)。作者使用視黃酸受體（RAR）激動(dòng)劑LG100268和TTNPB刺激OA處理的HepG2，結(jié)果顯示細(xì)胞中PCK1和G6PC表達(dá)上調(diào)，且能被維甲酸X受體（RXR）拮抗劑HX531和Ro41-5253抑制，但PPARγ（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ亞型）的激動(dòng)劑和抑制劑均對(duì)PCK1和G6PC的表達(dá)無(wú)影響，說(shuō)明RXR和RAR可能參與OA處理的HepG2細(xì)胞中PCK1和G6PC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而后使用Rald刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Rald能抑制RAR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PCK1和G6PC上調(diào)，其中對(duì)LG100268的抑制效果更為顯著，說(shuō)明Rald抑制了RXR誘導(dǎo)的PCK1和G6PC的表達(dá)。CYP26A是RAR的已知靶基因，Rald和TTNPB均顯著誘導(dǎo)CYP26A表達(dá)，并且Rald進(jìn)一步增強(qiáng)了LG100268+TTNPB誘導(dǎo)的CYP26A上調(diào)，而Ro41-5253完全消除了Rald對(duì)CYP26A的誘導(dǎo)作用，綜合來(lái)看，Rald是RAR的激動(dòng)劑和RXR的拮抗劑。

圖6. Rald通過(guò)拮抗RXR抑制PCK1和G6PC的表達(dá)

為探究Rald/RA對(duì)RXRa/RARa激活的影響，作者進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定Rald/RA對(duì)RARa/RXRa激活情況，首先Rald和RA以濃度依賴的方式刺激RARα，結(jié)果顯示Rald和RA分別激活RARα，但是Rald拮抗RA誘導(dǎo)的RARα激活，表明Rald是RARα的激動(dòng)劑。緊接著作者利用RA、9C-RA（9順式RA）、Rald和OA以濃度依賴的方式刺激RXRa，結(jié)果顯示RA、9C-RA和OA激活RXRa，但Rald拮抗RA或者OA誘導(dǎo)的RXRa激活，對(duì)于此種現(xiàn)象作者進(jìn)行分子對(duì)接以研究Rald對(duì)RXRa的拮抗作用，結(jié)果表明，Rald、RA、9C-RA和OA以不同親和力緊密結(jié)合在RXRa配體結(jié)合口袋中（Rald>9C-RA>RA>OA），但是與其他組相比，Rald與丙氨酸-327間沒(méi)有氫鍵，因此在RXRa的結(jié)構(gòu)域中表現(xiàn)出獨(dú)特的分子構(gòu)型，RXRa結(jié)構(gòu)域螺旋11外展抑制了RXRa激活物可結(jié)合表面的形成，這也是Rald對(duì)RXRa拮抗作用的證明。

圖7. Rald拮抗RXRα并激活RARα

一般情況下，RXR會(huì)與核受體形成同源二聚體或異源二聚體，通過(guò)與基因不同的DR區(qū)（結(jié)構(gòu)域）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在人原代肝細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)Rald影響SREBF1、CYP4F2和RARB2的表達(dá)，這些基因被報(bào)道受到不同DR的調(diào)節(jié)。SREBF1和CYP4F2受DR1調(diào)控，GCK和CRABP2受DR2調(diào)控，RARB2和CYP26A受DR5調(diào)控，而Rald對(duì)PCK1和G6PC調(diào)控模式，與DR1調(diào)控SREBF1和CYP4F2的調(diào)控模式相似。作者為了證明自己的發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建了三個(gè)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（RXR：RXR-DR1，RAR：RXR-DR1和RAR：RXR-DR5）進(jìn)行探究，熒光素酶報(bào)告分析進(jìn)一步證實(shí)，Rald作為RXR的拮抗劑，通過(guò)抑制RXR：RXR-DR1的激活，下調(diào)PCK1和G6PC的表達(dá)，進(jìn)一步證明肝臟Rald缺乏參與了T2D的惡化。

圖8. Rald通過(guò)拮抗RXR：RXR-DR1的激活下調(diào)PCK1和G6PC的表達(dá)

綜上所述，作者通過(guò)對(duì)T2D小鼠分析，發(fā)現(xiàn)T2D誘導(dǎo)肝臟RALDH1表達(dá)，導(dǎo)致肝臟Rald缺乏，Rald治療或肝臟RALDH1沉默可以抑制T2D狀態(tài)下亢進(jìn)的糖異生。而Rald作為RXR的拮抗劑，在肝細(xì)胞上抑制RXR/DR1介導(dǎo)的PCK1和G6PC表達(dá)，同時(shí)Rald也可作為RAR的部分激動(dòng)劑，維持RAR正常生理活性，對(duì)維持血糖穩(wěn)態(tài)具有重要作用，肝臟Rald缺乏則增強(qiáng)肝臟糖異生進(jìn)而加劇T2D的惡化。這些結(jié)果證明了Rald在T2D惡化中的作用，并為開(kāi)發(fā)以RALDH1抑制劑或Rald為基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)T2D的治療藥物提供理論依據(jù)。