眾所周知，微波會產(chǎn)生熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，微波消融可產(chǎn)生熱效應(yīng)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，并已廣泛應(yīng)用于癌癥治療，然而，微波對免疫系統(tǒng)的非熱效應(yīng)在很大程度上仍未得到探索。因此揭示多頻微波對免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)至關(guān)重要。2022年11月，軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所姚傳福老師在《Cells》上發(fā)表了一篇題為“The Biological Effects of Compound Microwave Exposure with 2.8 GHz and 9.3 GHz on Immune System: Transcriptomic and Proteomic Analysis.”的研究文章。該研究通過檢測大鼠血液和脾臟轉(zhuǎn)錄組與蛋白組，揭示了多頻微波對免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)，為探索其潛在機(jī)制提供了重要線索。

標(biāo)題：The Biological Effects of Compound Microwave Exposure with 2.8 GHz and 9.3 GHz on Immune System: Transcriptomic and Proteomic Analysis.

期刊：Cells（IF =7.666）

時間：2022.11

背景

微波可引起多器官癥狀，不同頻率、功率和持續(xù)時間的微波在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)效應(yīng)已得到廣泛研究。此外，在體內(nèi)和體外也證明了其影響的幾種潛在機(jī)制。例如，2.8 GHz的微波照射可引起miR-30a-5p/AMPKα2信號通路誘導(dǎo)發(fā)生神經(jīng)元自噬。免疫系統(tǒng)在保護(hù)人類免受內(nèi)部突變和外部刺激方面起著關(guān)鍵作用。然而，微波誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的生物效應(yīng)在很大程度上仍未得到探索。

研究思路

在本研究中，研究者將大鼠暴露在日常生活中廣泛使用的平均功率密度為?10 mW/cm2?的?2.8 GHz?和?9.3 GHz?多頻微波中，為研究其對免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)及潛在生物機(jī)制，文章使用以下實驗策略：（蛋白組和轉(zhuǎn)錄組由北京青蓮百奧生物科技有限公司提供）。1、檢測微波暴露對免疫器官引起的累積病理損傷；2、探查了多頻微波對外周血的免疫影響情況以及外周血中特定細(xì)胞因子表達(dá)情況；3、轉(zhuǎn)錄組分析揭示多頻微波在mRNA水平上的調(diào)控表達(dá)并進(jìn)行PCR驗證；4、蛋白組分析揭示多頻微波調(diào)控的相關(guān)蛋白并進(jìn)行PRM驗證；

研究內(nèi)容

1、2.8?和?9.3 GHz?微波對免疫器官引起的累積病理損傷

作者將大鼠隨機(jī)分為4組：Sham組、2.8GHz單頻微波暴露組（S10）、9.3GHz單頻波暴露組（X10）和2.8GHz加9.3GHz多頻微波暴露（XS10）。S10和X10組的大鼠暴露于平均功率密度為10mW/cm2的2.8GHz和9.3GHz脈沖微波6分鐘。XS10組的大鼠依次暴露于2.8GHz微波和9.3GHz微波各6分鐘。

在微波處理后的指定時間點，檢測免疫器官的病理改變。首先6 h至28 d骨髓未觀察到明顯變化；胸腺和脾臟在6h時未檢測到明顯變化，但在單頻微波和多頻微波處理后7d和14d后出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷情況，如淋巴細(xì)胞的充血和核碎裂。然而，胸腺和脾臟的結(jié)構(gòu)在28 d幾乎恢復(fù)正常，推測可能存在自我恢復(fù)機(jī)制。由于兩組織在第7d產(chǎn)生損傷情況嚴(yán)重，所以進(jìn)一步分析了微波處理后7d時的脾臟超微結(jié)構(gòu)，Sham組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)排列有序，線粒體分布均勻，嵴橫向和縱向排列；單頻微波處理的脾臟中只能檢測到輕微的改變；結(jié)果顯示，暴露于多頻微波會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞核染色質(zhì)凝結(jié)和細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器凝固，即暴露于2.8 GHz和9.3 GHz的多頻微波會對胸腺和脾臟的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生累積性損傷。

?2、多頻微波擾亂外周血的免疫平衡

免疫穩(wěn)態(tài)對于保護(hù)身體免受病毒感染和細(xì)胞突變十分重要。在這項研究中，作者分析了微波照射后的外周血中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。多頻微波（非單頻微波）在輻射后7d白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞顯著增加；28d白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到正常水平，表明免疫平衡被微波短暫調(diào)節(jié)以維持免疫穩(wěn)態(tài)。

接下來檢查了外周血中淋巴細(xì)胞的亞型，包括T細(xì)胞和B細(xì)胞。微波暴露組中B淋巴細(xì)胞比例在處理后6 h和7 d增加，XS10組檢測到更顯著的升高，表明多頻微波處理可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖。如同預(yù)期，微波處理后T淋巴細(xì)胞的比例降低。XS10組與Sham組之間以及X10組與Sham組在暴露后7 d間差異顯著。B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的比例在暴露后28 d恢復(fù)到正常水平，與外周免疫細(xì)胞的改變一致。采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4 T淋巴細(xì)胞與CD8 T淋巴細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露后4 d，X8組和XS10組CD10/CD7 T細(xì)胞比例明顯下調(diào)，28 d恢復(fù)正常，推測T淋巴細(xì)胞平衡受到調(diào)節(jié)。

?3、多頻微波處理調(diào)控B淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

細(xì)胞因子分泌是調(diào)節(jié)免疫功能的重要機(jī)制。作者分析了幾種與外周血中B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖、成熟、活化有關(guān)的細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)顯示，X10和XS10組IL-4α、IL-6β和IL-10濃度在10 h顯著升高，但I(xiàn)L-1α和IL-4在處理后7 d迅速恢復(fù)到正常水平。這些細(xì)胞因子與B淋巴細(xì)胞的增殖、成熟和活化密切相關(guān)，推測這可能與大鼠微波處理后7d?B淋巴細(xì)胞比例升高有關(guān)。2.8 GHz微波處理后6hIL-12和IFN-γ的表達(dá)顯著降低，而9.3 GHz微波輻照對TNF-α和IL-12的表達(dá)均有明顯上調(diào)。雖然多頻微波也下調(diào)了IFN-γ，但調(diào)控效果較弱。這些數(shù)據(jù)表明，T淋巴細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子受到2.8 GHz和9.3 GHz微波的差異調(diào)節(jié)。

4、多頻微波處理改變了外周血中的?mRNA?和蛋白質(zhì)表達(dá)

多頻微波處理后在7 d時間點可對免疫器官造成明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，并改變免疫細(xì)胞的數(shù)量，成分和功能。為了研究潛在的機(jī)制，對暴露后7 d的外周血樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果表明，微波照射誘導(dǎo)了許多差異基因表達(dá)。與Sham組相比，S10組檢測到114個上調(diào)基因和32個下調(diào)基因。在X10組中發(fā)現(xiàn)了更多的差異表達(dá)基因（DEGs），（373個上調(diào)基因和254個下調(diào)基因）。與S10和X10微波相比，多頻微波誘導(dǎo)的DEGs多，包括548個上調(diào)基因和311個下調(diào)基因。結(jié)果顯示：累積效應(yīng)可能由多頻微波引起。

選取與免疫調(diào)控密切相關(guān)的DEGs進(jìn)行功能驗證。通過qRT-PCR分析直接參與免疫應(yīng)答的DEGs（如Il17ra，Pglyrp1，WAS和Atic）以及間接調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)DEGs（如Sept1，Mal，Ahcy和Nxf1）。數(shù)據(jù)顯示，這些DEG的表達(dá)改變與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果一致。GO分析表明，DEGs與細(xì)胞代謝和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，DEGs富集在免疫系統(tǒng)過程、對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程和代謝過程等生物過程中；KEGG分析表明，DEGs富集在幾種免疫相關(guān)信號通路中，例如免疫相關(guān)信號通路，包括B細(xì)胞受體信號通路，內(nèi)吞作用，Toll樣受體信號通路，抗原加工和呈遞，人T細(xì)胞白血病病毒1型感染，IL-17信號通路，Th17細(xì)胞分化，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和原發(fā)性免疫缺陷。

蛋白組學(xué)分析方面與mRNA表達(dá)相比，微波暴露組和Sham組之間的差異表達(dá)蛋白（DEPs）要低得多。在S10組中，20個蛋白質(zhì)上調(diào)，69個蛋白質(zhì)下調(diào)，而X10組發(fā)現(xiàn)80個上調(diào)蛋白質(zhì)和10個下調(diào)蛋白質(zhì)。此外，多頻微波誘導(dǎo)的DEPs多于單頻微波，包括25種上調(diào)蛋白和99種下調(diào)蛋白。四個DEPs，Camk1，Cast，Napsa和Stk26被選中進(jìn)行驗證。PRM質(zhì)譜驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的結(jié)果類似，GO分析結(jié)果表明，許多DEPs富集在免疫相關(guān)的生物過程之中，包括免疫應(yīng)答，補(bǔ)體激活，趨化因子介導(dǎo)的信號通路，B細(xì)胞受體信號通路，B細(xì)胞活化的正向調(diào)節(jié)，免疫球蛋白的產(chǎn)生；KEGG分析表明，許多DEPs是位于免疫相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵蛋白，例如自噬，內(nèi)吞作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，鈣信號通路，F(xiàn)cεRI信號通路，蛋白質(zhì)輸出，線粒體自噬。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，推測多頻微波可以通過調(diào)節(jié)許多免疫相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)來調(diào)節(jié)外周的免疫平衡。

5、多頻微波處理影響脾臟中的?mRNA?和蛋白質(zhì)表達(dá)

脾臟作為大的外周免疫器官，在細(xì)胞和體液免疫中起著關(guān)鍵作用。與外周血的發(fā)現(xiàn)不同，XS10組脾臟中的DEGs相對于S10和X10組僅略有變化。數(shù)據(jù)表明，脾臟對S10組的微波環(huán)境比外周血更敏感。采用qRT-PCR驗證了Kiaa0408L、Dnaja1、Zbtb16和Sowahb等多個DEGs的表達(dá)，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果一致。此外，還檢測到幾種與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因，如Serpine1，Mal，Ahcy和Nxf1。GO分析表明，DEGs主要富集在與免疫活性密切相關(guān)的生物過程中，如免疫系統(tǒng)反應(yīng)、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)細(xì)胞過程、細(xì)胞成分生物過程、多細(xì)胞生物過程；KEGG分析表明，DEGs參與了幾種免疫相關(guān)的信號通路，包括TGF-β信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、人瘤病毒感染、抗原加工和呈遞以及Hippo信號通路。這些數(shù)據(jù)表明，微波暴露可以改變mRNA表達(dá)譜，影響脾臟的免疫穩(wěn)態(tài)。

蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中X10單頻微波處理組中誘導(dǎo)的DEPs多。然后，采用PRM驗證Timm8b、Cbr3、Fth1和Napsa等多個DEPs，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，由于微波對直接免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控較弱，微波可能通過調(diào)節(jié)微波暴露后細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白來影響脾臟的免疫過程。GO分析結(jié)果表明，DEPs富集于代謝和免疫相關(guān)生物過程中，如葡萄糖代謝過程、B細(xì)胞凋亡過程負(fù)調(diào)控和T細(xì)胞能量負(fù)調(diào)控。此外，X10組中的DEPs參與了許多免疫相關(guān)的生物學(xué)過程，如補(bǔ)體活化、白細(xì)胞介素-10生物合成過程的正向調(diào)控、循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答、凝血酶活化受體信號通路的負(fù)調(diào)控、白細(xì)胞介素-13生物合成過程的正向調(diào)控、對腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的正向調(diào)控、白細(xì)胞介素-4生物合成過程的正向調(diào)控和 參與免疫反應(yīng)的自然殺傷細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)。KEGG分析表明，DEPs主要參與代謝和免疫相關(guān)信號通路，如谷氨酸能突觸、甘油磷脂代謝、膽固醇代謝和半胱氨酸和蛋氨酸代謝、TGF-β信號通路和Toll樣受體信號通路。這些數(shù)據(jù)表明，微波可能通過直接影響免疫相關(guān)蛋白和通過影響細(xì)胞代謝間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)脾臟中的免疫功能。

總結(jié)

2.8 GHz和9.3 GHz的多頻微波處理后7d對胸腺和脾臟均造成明顯損傷，處理后28 d恢復(fù)。多頻微波處理使外周血中的免疫細(xì)胞增多，特別是B淋巴細(xì)胞，這可能歸因于細(xì)胞因子升高，以及許多免疫相關(guān)基因的上調(diào)，如Cxcr5，Blnk和Pik3cd。此外，外周血和脾臟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，DNA復(fù)制，細(xì)胞代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變可能與微波誘導(dǎo)的免疫激活有關(guān)。