ER-Tracker Green,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)綠色熒光探針(活細(xì)胞)（BODIPY FL 格列本脲）探針是一種具有細(xì)胞通透性的活細(xì)胞染色劑，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 具有高度選擇性染料，不像傳統(tǒng)的DiOC6(3)，該染色劑由發(fā)綠色熒光的 BODIPY? FL 染料和格列本脲組成。格列本脲（聚糖）可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的 ATP 敏感性 K+ 通道的硫化脲受體結(jié)合；格列本脲活性可能影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。部分專用細(xì)胞類型中的硫化尿素受體不定可變表達(dá)可能引起非 ER 標(biāo)記。該系列探針幾乎不對(duì)線粒體著色，且在較低濃度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色，且對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性。使用以下提供的優(yōu)化步驟對(duì)活細(xì)胞染色后用醛固定，可以部分保留活細(xì)胞的染色特征。?熒光波長：Excitation: 504 nm, Emission: 511 nm。

圖1：ER-Tracker Green結(jié)構(gòu)式

ER-Tracker Green（BODIPY FL 格列本脲）使用方法

本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)化，且已被其他常規(guī)細(xì)胞系驗(yàn)證。但不同的細(xì)胞類型其最佳使用條件不同，還需用戶根據(jù)該方案進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。
1. 準(zhǔn)備試劑
使用前將ER-Tracker Green (BODIPY? FL Glibenclamide)回溫至室溫，并簡(jiǎn)短離心使該DMSO溶液至管底。
2. ?細(xì)胞樣品處理及染色
2.1 將1mM ER-Tracker Green (BODIPY? FL Glibenclamide)儲(chǔ)存液按照實(shí)驗(yàn)要求稀釋至工作濃度，推薦工作濃度為～1μM。建議在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下盡量使用較低濃度探針，以避免由于濃度過高染色導(dǎo)致的假象。
注：使用含Ca2+、Mg2+ Hank’s 平衡鹽溶液（HBSS/Ca/Mg）稀釋該探針進(jìn)行染色，可得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2.2 染色過程
對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用HBSS清洗細(xì)胞，加入預(yù)熱的染料工作液于37℃孵育細(xì)胞15-30min。吸除染色液，加入不含探針的新鮮培養(yǎng)液，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。
細(xì)胞如需固定，請(qǐng)參考以下步驟。
3．細(xì)胞固定
3.1 固定細(xì)胞：用4%甲醛于37℃固定細(xì)胞2min。
注：已染色細(xì)胞用醛固定后，僅部分ER-Tracker Green (BODIPY? FL Glibenclamide)留在細(xì)胞內(nèi)，熒光信號(hào)會(huì)有部分衰減。
3.2 清洗觀察細(xì)胞：細(xì)胞固定后，可用合適緩沖液進(jìn)行清洗，每次5min，共2次。清洗后可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)封片、鏡檢或進(jìn)一步染色。
注：不建議對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理，因?yàn)榻?jīng)Triton X-100透化后，無信號(hào)保留。

圖2：用 ER-Tracker Green 和 MitoTracker Red CMXRos 標(biāo)記的活牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。