數(shù)字PCR（dPCR）是一種核酸絕對定量的技術(shù)，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）相比，dPCR擁有可以精確到單個核酸分子的高精準(zhǔn)度、適合復(fù)雜樣本的高便捷度、且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因進(jìn)行對比分析等特點(diǎn)。因此，高靈敏度、絕對定量、高穩(wěn)定性和更高的抗干擾能力成為數(shù)字PCR的4大優(yōu)勢。

基于下一代測序(NGS)的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查(NIPT)在篩查胎兒非整倍體方面優(yōu)于傳統(tǒng)的血清生化檢查(SBT)，具有較高的敏感性和特異性。然而，由于其高成本，它還沒有被廣泛用作初級篩選工具，并且更便宜的SBT仍然是初級篩選的選擇，即使在靈敏度和特異性方面存在眾所周知的不足。鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳與產(chǎn)前診斷中心，報道了一種多重微滴數(shù)字PCR NIPT (dPCR-NIPT)檢測法，它可以在單管反應(yīng)中檢測三體21、18和13 (T21、T18和T13)，其靈敏度和特異性比SBT更好，價格比NGS-NIPT便宜得多。

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該篇文獻(xiàn)是關(guān)于dPCR-NIPT分析的第一份報告，該分析包括從樣品處理到多重dPCR擴(kuò)增的所有必要試劑（包括樣品處理、cffDNA組分富集、靶細(xì)胞游離DNA (cfDNA)濃度富集和dPCR擴(kuò)增試劑)，可以在單管反應(yīng)中檢測T21、T18和T13。研究結(jié)果表明，該方法的敏感性和特異性優(yōu)于SBT，而成本遠(yuǎn)低于NGS-NIPT法。因此，從檢測性能和經(jīng)濟(jì)效益的角度來看，使用dPCR-NIPT檢測代替SBT作為主要篩查工具，然后進(jìn)行NGS-NIPT再篩查，將是比現(xiàn)有CS更好的檢測母體血漿中胎兒非整倍體的方法。

???為了評估這種dPCR-NIPT分析在真實(shí)臨床環(huán)境中的表現(xiàn)，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院通過測試真實(shí)的臨床樣本來執(zhí)行整個分析過程。本研究共招募了453名單胎妊娠的高危孕婦，通過醫(yī)院常規(guī)的第一和/或第二孕期胎兒非整倍體篩查(包括SBT和/或超聲)確定其高危狀態(tài)。該人群中的一些妊娠是由他們的醫(yī)生直接選擇或規(guī)定進(jìn)行NGS-NIPT篩查的，除了少數(shù)幾個，所有通過SBT和/或超聲波確定的高危妊娠都進(jìn)一步通過NGS-NIPT方法重新篩查，以確認(rèn)高危結(jié)果并過濾掉假陽性。NGS-NIPT高危妊娠最終由侵入性CVS/AC程序診斷。一份單獨(dú)的等分試樣(約2.5毫升)的每個母體血漿樣品在-20℃下保存，用于該dPCR-NIPT測試。在453個樣本中，隨機(jī)挑選了170個(包括2個T21、1個T18和1個T13樣本)用作現(xiàn)場訓(xùn)練和檢測關(guān)鍵程序驗證的訓(xùn)練集，以及用于建立該檢測的整倍體基線臨界值。剩余的283個樣本(包括25個T21、10個T18和1個T13樣本)作為測試集，通過dPCR-NIPT試驗以盲法進(jìn)行篩選。

?????首先進(jìn)行樣本的制備，使用Qubit 3熒光計和Qubit DS DNA和BR Array Kit (Thermo Fisher，USA)測量每個分離樣品（2.5ml的血漿）的cfDNA濃度，只有DNA濃度≥ 0.2 ng/μL的樣品才有資格進(jìn)行dPCR-NIPT分析；另外為了提高檢測靈敏度，應(yīng)用多重dPCR來定量21號染色體、18號染色體和13號染色體(Chr21、Chr18和Chr13)，分別用FAM、VIC和Cy5熒光團(tuán)標(biāo)記Chr21、Chr18和Chr13的檢測探針，以區(qū)分?jǐn)U增信號。在一系列評估實(shí)驗后，為三條染色體(Chr21、Chr18和Chr13)中的每一條選擇10組引物和探針用于該dPCR-NIPT分析。本研究中的dPCR-NIPT檢測，使用了BioDigital-QING dPCR系統(tǒng)(中國上海小海龜科技有限公司，)，它由三個獨(dú)立的儀器組成:BioDigital-QING Loader；另外對于測試集樣本，從2.5毫升母體血漿中分離的cfDNA濃度相對較低，平均值和中值分別為0.36和0.34ng/ul(范圍為0.20-0.87ng/ul)。因此，需要預(yù)擴(kuò)增(PA)步驟來提高目標(biāo)cfDNA濃度，以進(jìn)行準(zhǔn)確的CCN定量；并經(jīng)過測試PA對CCN沒有顯著影響，因此，決定在dPCR-NIPT分析中加入PA步驟。（如下圖）

總的測試結(jié)果表明，具有最少18000個液滴的dPCR-NIPT測定法具有顯著的統(tǒng)計學(xué)能力，以95%的置信度區(qū)分非整倍體和整倍體噪聲，并且容易應(yīng)用于臨床上篩查胎兒非整倍體的妊娠。這種分析可以在三個方面進(jìn)一步改進(jìn)，使用具有多個熒光檢測通道和最少80000個PCR分區(qū)的dPCR系統(tǒng)，將血漿樣品體積增加到4 mL，并不斷優(yōu)化測試試劑以提高準(zhǔn)確性和減少差異。當(dāng)通過等式估計時，具有至少80000個PCR分區(qū)的dPCR系統(tǒng)可以將測試置信度增加到99.9%。通過檢測來自高危妊娠的283份血漿樣品來驗證該分析的臨床性能，并證明dPCR-NIPT分析的靈敏度和特異性優(yōu)于SBT。根據(jù)基于當(dāng)前市場價格的簡要成本效益分析，與現(xiàn)有的CS和作為一級篩查策略的NGS-NIPT相比，升級后的CS是最經(jīng)濟(jì)的篩查方法，其中dPCR-NIPT分析被用作初級篩查工具，隨后是NGS-NIPT重新篩查，具有更高的敏感性和特異性來篩查孕婦的胎兒非整倍體。

那么上述的數(shù)字PCR儀來自哪家國內(nèi)公司呢？

????上海小海龜科技有限公司立足于基因檢測上游儀器、芯片耗材與試劑開發(fā)的高新技術(shù)企業(yè)，其以微流控芯片技術(shù)為核心，已成功推出BioDigital 青數(shù)字PCR分體機(jī)、以及BioDigital ? 炎和SCI Digital系列數(shù)字PCR全自動一體機(jī)，實(shí)現(xiàn)了基因檢測與分子診斷前沿技術(shù)領(lǐng)域的重大原始材料科技創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化突破。

每個課題組都用的起、用的好的全自動一體機(jī)

SCI Digital

產(chǎn)品詳情：

●?全自動一體機(jī)：核酸進(jìn)，結(jié)果出，無需手動加樣和樣本轉(zhuǎn)移

●??占桌面面積：僅約0.2平方米（W*L*H:?453*498*490?mm）

●??極致的開機(jī)成本：低至一個樣本也能開機(jī)，1~12樣本通量

●??廣泛的試劑兼容性：廣泛兼容市場PCR MIX，試劑盒開發(fā)更簡單

●??靈活的樣本配置：兼容12連管、8連管及單個反應(yīng)管

●??多路熒光組合方案：2/3/4/5路熒光通道

●??微滴數(shù)量：~2萬

●??制備時間：<2分鐘/樣本

●??有效液滴比例：~95%

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BioDigital 青--真正的液滴制備全自動PCR

??中國第一張計量評價證書

??獲得醫(yī)療器械注冊

??兼容超多重技術(shù)

??分體機(jī)

BioDigital ? 炎--最靈活易用的全自動數(shù)字PCR一體機(jī)?

產(chǎn)品詳情：

真正的全自動一體機(jī)數(shù)字PCR：核酸進(jìn)，結(jié)果出，無需手動加樣和樣本轉(zhuǎn)移，兼容24孔板、8連管及單個反應(yīng)管

5 熒光通道——多重/超多重檢測

雙獨(dú)立溫控——樣本隨到隨檢

雙模式檢測——兼容準(zhǔn)實(shí)時熒光檢測功能

廣泛的試劑兼容性：廣泛兼容市場PCR Mix，試劑盒開發(fā)更簡單

樣本通量：1~24樣本，配置最靈活

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