1.細菌污染的特征

細菌污染是細胞培養(yǎng)中最常見的污染，其污染主要來源于實驗室環(huán)境、實驗人員、實驗服、實驗耗材、共用試劑等，甚至在細胞培養(yǎng)過程中添加雙抗，也經(jīng)常因為操作不慎而引起污染。

很多實驗人員容易將細菌和“黑膠蟲”區(qū)分不清，極易造成污染種類判斷錯誤而“延誤病情”，“黑膠蟲”是一種常見的細胞污染物，與細胞競爭性生長，對細胞生長不利，嚴重時導致細胞死亡。目前很多細胞存在被“黑膠蟲”污染的現(xiàn)象，對細胞培養(yǎng)及其后續(xù)實驗造成了極大地影響。

“黑膠蟲”污染與細菌污染最明顯的一個差別就是：“黑膠蟲”污染的培養(yǎng)基不渾濁，在顯微鏡下觀察，細胞周圍和培養(yǎng)液中有“黑膠蟲”呈現(xiàn)布朗運動。細菌污染在1~2后會出現(xiàn)渾濁、PH下降變黃，污染初期培養(yǎng)基肉眼觀察無明顯改變，只有在倒置顯微鏡下仔細觀察才能發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內“一穿而過”的細菌，所以需要實驗員每天細心觀察才能及時發(fā)現(xiàn)細菌污染，一般細菌污染進程很快，有的細胞在培養(yǎng)箱過夜后肉眼就能顯著觀察到渾濁，在顯微鏡下可以觀察到黑點在培養(yǎng)基內游動，細胞變圓或者崩潰，從壁上脫落死亡。

2.清除細菌污染操作規(guī)程

從-20℃冰箱內取出細菌清除劑，將試劑管瞬時離心（3000rpm，3~5s）后放置于EP管架上，用75%的酒精噴灑試劑管的表面，在生物安全柜中進行無菌操作；

以T25細胞培養(yǎng)瓶為例

對于培養(yǎng)基中有偶有黑點穿過但未見明顯渾濁的細胞，處于細菌污染初期，需要立即更換為含有細菌清除劑的完全培養(yǎng)基，通常推薦使用的稀釋倍數(shù)為2000×，如：6mL的完全培養(yǎng)基加入3μL的細菌清除劑混勻，連續(xù)加藥培養(yǎng)1~2周即可有效清除細菌污染。

對于培養(yǎng)基突然變黃并明顯沙化渾濁的細胞，此時細菌污染已非常嚴重，需要酌情增加藥物濃度以提高清除細菌的效率，建議提高至1000×濃度進行清除，如：6mL的完全培養(yǎng)基加入6μL的細菌清除劑混勻。每天換液兩次，建議上午進入實驗室進行一次加藥培養(yǎng)基換液，下午離開實驗室之前進行一次加藥培養(yǎng)基換液，第二天和第三天重復此過程，第四天開始即可每天換液一次，連續(xù)加藥培養(yǎng)1~2周（或傳代3次）后，無菌檢測判斷是否還存在細菌污染。

注意：

① 貼壁細胞換液或傳代前，棄去舊的培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細胞表面2次。

② 若細胞達到可傳代比例，請及時傳代并鋪入新的細胞培養(yǎng)瓶，換新瓶的過程也可有效規(guī)避培養(yǎng)瓶壁上殘留細菌的污染；

③ 細菌清除干凈后，必須進行傳代并鋪入新的細胞培養(yǎng)瓶，且在新瓶中加藥維持1~2天后，才可以撤掉細菌清除劑，避免在舊瓶中撤藥后舊瓶壁上的細菌殘留造成二次污染；

④ 由于胚胎干細胞（H1、H9、iPS）非?！按嗳酢?，若污染嚴重，建議采用2000×濃度清除細菌。

3.預防細菌污染操作規(guī)程

若細胞需連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)存在共用實驗儀器、耗材、試劑或實驗室曾經(jīng)出現(xiàn)過大規(guī)模的細菌污染，建議每2~3周進行定期預防。在細胞培養(yǎng)基中加入適量細菌清除劑，通常推薦使用的稀釋倍數(shù)為3000×，如：6mL的細胞培養(yǎng)基加入2μL的細菌清除劑混勻。連續(xù)加藥培養(yǎng)1周后即可有效防止細菌污染或抑制細菌增殖。

4.實驗流程圖

5. 特別提醒

① 為了發(fā)揮最好的藥效，含藥培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，如果加藥培養(yǎng)基未用完，于4℃冰箱中避光保存，2周內用完，使用培養(yǎng)基前需預熱至37℃；

② 如遇個別細胞對本試劑敏感，細胞生長速度明顯受影響時，建議減量使用或進行稀釋度測試；

③ 細菌清除劑處理后，會有很好的預防和清除效果，但是如果環(huán)境、耗材、試劑中仍有污染源存在，細胞可能會再次污染，因此需做好適當?shù)念A防措施；

6.清除案例