深入解析基因的功能及與其相互作用關(guān)系是分子生物學(xué)的主要目標(biāo)。質(zhì)譜法與傳統(tǒng)的生物化學(xué)工具如親和純化或排阻色譜法結(jié)合，不僅能表征整個蛋白質(zhì)的組成，而且可以直接檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。雖然其功能強(qiáng)大，但是用這些方法深入了解蛋白的原位狀態(tài)，反映蛋白質(zhì)與代謝物，蛋白質(zhì)與核酸等相互作用方面仍然具有挑戰(zhàn)。

2020年12月9日，德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）的Athanasios Typas課題組和Mikhail M. Savitski課題組合作在Nature雜志上發(fā)表題為"The functional proteome landscape of Escherichia coli"的文章，在本研究中，作者結(jié)合反向遺傳學(xué)和熱蛋白質(zhì)組技術(shù)（TPP，thermal proteome profiling）描述大腸桿菌中的遺傳擾動對蛋白質(zhì)豐度和熱穩(wěn)定性的影響，為推斷蛋白質(zhì)功能和相互作用提供了豐富的資源。

研究材料：121株大腸桿菌（來自Keio library的單基因缺失突變體）

技術(shù)方法：熱蛋白組學(xué)，代謝組學(xué)

實(shí)驗(yàn)路線圖：

研究結(jié)果：

1.?高通量熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析

作者對121株大腸桿菌（單基因突變體）進(jìn)行熱蛋白組學(xué)分析，即對生長至指數(shù)階段的突變體，加熱10個不同溫度以誘導(dǎo)蛋白變性，隨后收集每個溫度下細(xì)胞裂解后的可溶性蛋白，通過TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法進(jìn)行檢測（總共2420個樣本：121個突變體×2個重復(fù)體×10個溫度） 。結(jié)果表明：2586個蛋白至少含有2個唯一肽段，在整個遺傳背景下，檢測到1764種蛋白質(zhì)的豐度和熱穩(wěn)定性，其中 1213種蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化，而熱穩(wěn)定性和豐度測量值在很大程度上正交。

2. 必需蛋白熱穩(wěn)定性研究

由于必需基因（essential genes）的功能很難用遺傳學(xué)方法來研究，作者探討了必需基因在遺傳擾動中表現(xiàn)。結(jié)果顯示，由必需基因編碼的蛋白豐度更高，且豐度變化的頻率低于非必需基因編碼的蛋白，此外必需蛋白比非必需蛋白的穩(wěn)定性更易受到溫度影響，這提示它們的活性或相互作用非常容易在某些遺傳背景下受到調(diào)節(jié)。

作者進(jìn)一步通過CRISPRi技術(shù)，降低不同遺傳背景下FtsK（一種細(xì)胞分裂DNA移位酶）和ParC（拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的亞基）的水平，證實(shí)了其對野生型細(xì)胞的生長狀態(tài)影響輕微，但是細(xì)胞不能耐受在熱穩(wěn)定性受到影響的突變體中必需蛋白的消耗。這些數(shù)據(jù)提示細(xì)胞維持高水平的必需蛋白用于緩沖它們在不同條件下的活性變化，這種必需和非必需基因的合成致死性可以為組合藥物治療提供新途徑。

3. 功能相關(guān)蛋白的研究：蛋白豐度和熱穩(wěn)定性共同變化

作者通過斯皮爾曼相關(guān)性分析來評估在不同溫度下121個遺傳擾動中共同改變的蛋白對。結(jié)果表明：蛋白復(fù)合物（PRNAP），操縱子，代謝途徑相關(guān)蛋白（組氨酸生物合成）等高度相關(guān)，蛋白熱穩(wěn)定性能力不僅能夠進(jìn)一步捕捉蛋白的功能關(guān)聯(lián)性，而且可以根據(jù)每個數(shù)據(jù)集中的已知蛋白的生物學(xué)功能（GO注釋），對高度相關(guān)未知功能蛋白（孤兒蛋白）進(jìn)行功能鏈接，共發(fā)現(xiàn)140個孤兒蛋白可能與已知的生物過程相關(guān)。

4. 代謝酶熱穩(wěn)定性研究：酶的熱穩(wěn)定性反應(yīng)了酶的活性

為了解析代謝能力與酶活性變化的關(guān)系，作者利用代謝組學(xué)技術(shù)對19個突變體和野生型大腸桿菌細(xì)胞中糖酵解和檸檬酸循環(huán)代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些代謝物水平有著巨大變化；這種變化情況與酶熱穩(wěn)定性之間存在顯著相關(guān)性，但與酶豐度無關(guān)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了酶的熱穩(wěn)定性可以反映細(xì)胞內(nèi)代謝物（作為底物或者產(chǎn)物與酶相互作用）的水平。因此，TPP捕捉體內(nèi)的酶活性，為解析細(xì)胞代謝狀態(tài)，揭示酶與代謝途徑關(guān)聯(lián)能力提供了獨(dú)特的視角。

小編小結(jié)：

作者通過熱蛋白組學(xué)分析結(jié)合分子遺傳學(xué)方法，首次系統(tǒng)性描繪大腸桿菌突變體蛋白質(zhì)的豐度和熱穩(wěn)定性，確定了多種潛在的新的相互作用，也給未知功能蛋白賦予了功能注釋，并且為代謝物活動測量提供了一種新的方法。綜上所述，該研究提供的數(shù)據(jù)集可用于深入了解蛋白質(zhì)的功能和關(guān)聯(lián)性，該種方法也可以拓展應(yīng)用于其他生物體功能蛋白的研究。

中科新生命蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)品線介紹

※ 前中科院上海生科院蛋白質(zhì)研究分析中心，超過15年蛋白質(zhì)組分析與服務(wù)積累，提供各類樣本分析方案與實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案。

※ 嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，提供放心的數(shù)據(jù)。