狼與家犬的基礎(chǔ)毛色著色機理

色素沉淀是自然界中最明顯的多態(tài)性狀之一，表現(xiàn)于毛發(fā)、羽毛、鱗片等顏色的空間分布與色素類型。在所有的哺乳類與鳥類中，一組被稱為黑素細(xì)胞（melanocytes）的特殊細(xì)胞負(fù)責(zé)生產(chǎn)黑色素（melanin），這些黑素細(xì)胞位于皮膚、毛發(fā)、眼睛、內(nèi)耳、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟，成熟的黑色素細(xì)胞通過一個被稱為黑色素生成（melanogenesis）的過程產(chǎn)生黑色素，這些黑色素決定動物皮膚、毛發(fā)、眼睛、一些內(nèi)膜以及鱗片和羽毛等身體覆蓋物的顏色。

在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，被稱為黑素母細(xì)胞（melanocytes）的黑素細(xì)胞前體形成于被稱為神經(jīng)嵴的外胚層區(qū)域，這些黑素母細(xì)胞會遷移到整個身體并增殖分化為成熟黑素細(xì)胞，能夠產(chǎn)生黑色素。在這些成熟黑素細(xì)胞中有一種被稱為黑素體的細(xì)胞器，可執(zhí)行黑色素生成功能。皮膚中的黑素細(xì)胞的樹突結(jié)構(gòu)使周圍的角質(zhì)細(xì)胞滲透至整個表皮的基底層與毛囊中，黑素體通過這些樹突轉(zhuǎn)移至鄰近的角質(zhì)細(xì)胞中，用于產(chǎn)生色素。

在角質(zhì)細(xì)胞中，黑素體產(chǎn)生兩種類型的色素，分別為黑色或棕色的真黑素（eumelanin）與紅色或黃色的類黑素（pheomelanin），這兩種色素的類型與分布決定了動物毛發(fā)、眼睛、皮膚的顏色以及花紋與毛色的分布。

影響黑素細(xì)胞的變體通常也會影響其他由神經(jīng)嵴衍生的細(xì)胞系（內(nèi)分泌、神經(jīng)、骨骼等）。黑素細(xì)胞也位于眼睛與內(nèi)耳，因此一些色素表型經(jīng)常與眼睛、聽覺和神經(jīng)功能受損的情況共同遺傳。

在1957年，遺傳學(xué)家利特爾（Clarence Little）在《狗的毛色遺傳》（The Inheritance of Coat Colour in Dogs）中首次定義的犬類毛色表型，并且認(rèn)為毛色表型是由一些基因的互作形成的。利特爾用按照字母的順序排列的命名系統(tǒng)來確定這些基因的位置，分別為A（Agouti）、B（Black）、C（Chinchilla）、D（Dilute）、E（Extension）、G（Grey）、M（Merle）、P（Pink-eyed dilution）、S（Spotting）和T（Ticking）基因座。另外一個R基因座，代表Roan（毛色斑駁），也被假定，如今已被認(rèn)為與T基因座相同。如今除了C基因座和P基因座已不再被認(rèn)可外，上述定義仍然是用于描述控制家犬毛色表型基因的常用術(shù)語。B基因座最初被認(rèn)為產(chǎn)生黑色毛發(fā)，如今已被修訂成代表棕色毛發(fā)的B。另外兩個基因座，K（Black）和I（Intensity）基因座被用來描述毛色的進一步變化。到2021年，已知共有15個基因狼與家犬的毛色表型上起作用。許多毛色表型是由基因座內(nèi)和基因座之間的復(fù)雜的相互作用（如上位遺傳?epistatic genetic）造成的，其中一些仍未被確認(rèn)。

在家犬和狼的毛發(fā)中，毛囊內(nèi)的胞內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)色素的合成。黑皮素1受體（MC1R）基因、Agouti信號蛋白（ASIP）基因和犬β防御素103（CBD103）基因在這一途徑中調(diào)節(jié)真黑素與類黑素的相對合成量。這三個基因的相互作用通過一個叫做色素類型轉(zhuǎn)換（pigment-type switching）的過程決定家犬與狼的基礎(chǔ)毛色。

E基因座

E基因座上的MC1R基因位于狼和家犬的5號染色體上，編碼一個黑素細(xì)胞跨膜域受體，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，通過cAMP信號通路激活真黑素合成，隨后上調(diào)酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1. I）、OCA2黑素體跨膜蛋白（OCA2）和黑素體前體蛋白（PMEL）基因。位于24號染色體A基因座的ASIP基因編碼的細(xì)胞外配體與MC1R結(jié)合來拮抗cAMP信號通路，阻止a-黑素細(xì)胞刺激素（a-Melanocyte Stimulating Hormone）與MC1R結(jié)合來抑制真黑素合成，同時編碼一種旁分泌信號分子來促進類黑素合成。所以那些MC1R功能增強的變體或ASIP功能喪失的變體有利于真黑素而非類黑素的產(chǎn)生，反之亦然。位于16號染色體K基因座的CBD103基因可以編碼一種分泌肽，可抑制MC1R與ASIP的拮抗作用，促進真黑素的產(chǎn)生。

在狼與家犬的E基因座上有7個等位基因，e1-3、eA、E、EG和Em，按順序顯性依次遞增。其中e1、E、Em在家犬中非常常見，可能出現(xiàn)較早，而e2、e3、eA卻不那么常見（這里只討論常見的幾個等位基因）。

E基因是該基因座的野生型，編碼有功能活性的MC1R與真黑素，K基因座與A基因座上的基因都可以能正常表達。

e1基因是一種廣泛存在于各種家犬品種中的功能缺失突變，為MC1R啟動子區(qū)域的916位核苷酸由C變?yōu)門，從而使MC1R蛋白的第306個氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，從而使MC1R蛋白缺失11個氨基酸。該突變抑制真黑素產(chǎn)生，形成奶油色/隱性紅的毛色，并且該毛色有較大變異范圍，主要原因與15號染色體上的一個CNV（拷貝數(shù)變異）有關(guān)。

Em基因由MC1R基因的第706位核苷酸由A變?yōu)镚，使該蛋白的第264個氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)槔i氨酸而形成。該突變會上調(diào)家犬吻部短MC1R表達水平，使得吻部產(chǎn)生真黑素形成黑色的吻部。然而這種黑色吻部或被稱為黑色面具的表型只在某些遺傳背景上可見。

在許多哺乳動物中，MC1R的顯性等位基因編碼純黑色毛發(fā)，而對于家犬和狼來說，MC1R的等位基因只是決定是否產(chǎn)生黑色素，而黑色毛發(fā)的表達主要是由K基因座編碼。

A基因座

狼與家犬的A基因座表型很多樣，是由于存在多種獨立調(diào)節(jié)的且表達時空各不相同的ASIP異構(gòu)體形成的。每個ASIP異構(gòu)體都有一個獨特的啟動子和5‘非編碼第一外顯子。其中腹面啟動子（VP）異構(gòu)體只在腹部體表表達，使腹部毛色淡化。而毛發(fā)周期啟動子（HCP）異構(gòu)體只在毛發(fā)周期的某些階段表達，產(chǎn)生貫穿背部的帶狀深淺色素的毛發(fā)。第三種異構(gòu)體則不參與毛色變化。VP和HCP分別位于基因組的g.23335019和g.23378834。根據(jù)這些啟動子上下游區(qū)域結(jié)構(gòu)變異區(qū)分了VP的兩個單倍型（VP1和2）和HCP的五個單倍型（HCP1～5），在家犬中分離出五種ASIP被毛表型。這5種表型分別被稱為黑背（BB）、黑鞍（BS）、刺鼠色（AG）、陰影黃（SY）和顯性黃（DY），按順序顯性依次遞增。

AG刺鼠色（VP2-HCP2）是祖先表型，也就是典型的狼的毛色，有淺色腹部，背部毛桿底部到頂端有真黑素或真黑素與類黑素條紋。

SY陰影黃（VP2-HCP1）的毛發(fā)周期中ASIP表達量上升，比AG有更多類黑素，毛色通常為均勻的黃色，有黑色毛尖。

BS黑鞍（VP1-HCP4）與BB黑背（VP2-HCP3～5）都在HCP處有表現(xiàn)為ASIP功能喪失的單倍型，BS的VP1比BB的VP2的ASIP1活性更高，產(chǎn)生更多類黑素，使得犬只黃色毛發(fā)面積更大，黑色毛發(fā)在背部形成馬鞍狀區(qū)域。BS的表現(xiàn)具有漸進性，因此BS與BB幼犬一般難以區(qū)分，而隨著犬只成熟，類黑素的分布擴大，黑背與黑鞍犬只才容易區(qū)分。

DY顯性黃（VP1-HCP1）是由于背部與腹部ASIP高表達導(dǎo)致，毛色呈均勻的黃色，色調(diào)變化范圍大，但具體機制尚不明晰（可能有其他基因座參與修飾或者由于基因劑量變異造成）。

由于A基因座是E基因座的下位基因，因此A基因座的基因型只會影響在E基因座至少有一個E或Em等位基因的犬只毛色

還有第六種罕見的A基因座表型，被稱為隱性黑（recessive black），由兩個隱性ASIP等位基因?"a "的拷貝形成，該變體是由ASIP第4外顯子中96位的精氨酸變?yōu)榘腚装彼嵋?，會?dǎo)致ASIP1失活而產(chǎn)生黑色毛發(fā)。

在狼身上存在VP1與VP2，但HCP只有HCP1，HCP2，卻沒有HCP3～5。因為HCP3~5都不會使背部產(chǎn)生類黑素而導(dǎo)致背部為純黑色，很明顯這種表型在狼身上并不存在。

以下為兩幾只狼A基因座的VP與HCP基因型：?

VP1-HCP1/VP2-HCP2 ?(DY/AG)

VP2-HCP2/VP2-HCP2（AG/AG）

K基因座

狼和家犬的黑色毛發(fā)主要由K基因座調(diào)控。與A基因座一樣，K基因座是E基因座的下位基因，因此K基因座的基因型只會影響在E基因座至少有一個E或Em等位基因的犬只毛色。K基因座的三個等位基因分別為ky、kbr和KB，按順序顯性依次遞增。

KB基因是由于CBD103中一個3bp的框內(nèi)缺失形成，導(dǎo)致第23位甘氨酸缺失。從而使CBD103DG23和ASIP競爭與MC1R的結(jié)合位點，負(fù)責(zé)穩(wěn)定的真黑素的表達。

kbr基因會導(dǎo)致很多犬種的毛發(fā)呈現(xiàn)虎斑色，其斑紋毛色由不規(guī)則的深淺不一的類黑素和真黑素條紋組成。而在真黑素背景下是看不到虎斑色的，所以只有SY（VP2-HCP1）與DY（VP1-HCP1）個體上才能觀察到虎斑表型，而對于BS（VP1-HCP4）與BB（VP2-HCP3～5）犬只只有腹部或身體末端有虎斑。虎斑表型變化范圍很大，但具體機制未知。區(qū)分kbr與ky基因的遺傳變異尚未被描述，但被認(rèn)為是影響基因拷貝數(shù)的結(jié)構(gòu)變異 。

ky是祖先型等位基因，不影響ASIP與MC1R的活性，不會對狼和家犬的原有毛色產(chǎn)生影響。

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CBD103基因?qū)儆讦?防御素基因家族，該基因在家犬與狼的皮膚與呼吸道中表達，編碼由中性粒細(xì)胞（neutrophils）產(chǎn)生的哺乳動物抗菌肽，在先天性免疫中起作用，保護上皮細(xì)胞抵御病原體。而β-防御素基因在其他物種中沒有已知的與色素沉淀相關(guān)的過程，因此CBD103基因與家犬與狼等物種毛發(fā)顏色的關(guān)系可能顯示出色素沉淀與免疫的潛在聯(lián)系。

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在對于狼的K基因座基因型與表型描述中，黑色毛發(fā)的狼基因型為KB/ky與KB/KB，典型的灰色毛色的狼為ky/ky。

家犬與狼還有諸多基因座對毛色產(chǎn)生影響，這里暫時不作討論。

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黑狼KB等位基因的演化史與多效性功能探究

對于狼來說，灰色是其最典型的毛色，也符合大多數(shù)人對于狼的印象，它們并非單一的灰色，其腿部、胸腹部有淺色毛發(fā)。但在北美，狼的黑化頻率很高，很多地區(qū)的種群中的黑化個體甚至接近一半，尤其在西部地區(qū)。而在加拿大東部與五大湖地區(qū)黑狼則不太常見。在北美北極地區(qū)，狼的毛發(fā)基本為白色。（灰色毛發(fā)的狼隨著年齡增長導(dǎo)致細(xì)胞色素減少或面臨生理壓力時其毛發(fā)也有可能變?yōu)槟逃蜕虬咨?，而黑色毛發(fā)的狼會變?yōu)殂y色或白色）。

而在舊大陸，黑狼在可靠的文獻記錄中非常罕見，從19世紀(jì)開始可以找到零星報道，如今舊大陸的野生黑狼通常出現(xiàn)在狼與家犬有雜交的種群中。而對于國內(nèi)一些圈養(yǎng)狼中出現(xiàn)的黑狼，個人推測基本上為進口的原產(chǎn)于北美的狼或北美狼與本土狼雜交造成的，而非純種的本土狼。

早在1880年黃石公園一位黃石公園第二任園長諾里斯（Philetus W. Norris）在做當(dāng)年年度報告時，就描述過一種介于灰色的布法羅狼（buffalo wolf）與郊狼之間的黑褐色犬科動物，在公園中很常見。個人猜測，他對于該物種的描述可能就是指的黑化的狼，當(dāng)時他很可能把灰色毛發(fā)與黑色毛發(fā)狼當(dāng)成兩個不同的物種。

在1939年至1941年間，第一個在野外研究狼的博物學(xué)家——國家公園管理局阿道夫·穆里（Adolph Murie）對麥金利山國家公園（后被更名為德納利國家公園）對野生狼進行了生態(tài)學(xué)研究，并在他1944年的專著《麥金利山的狼》（The Wolves of Mount McKinley）中描述了狼毛色的多樣性，并推測原因可能和野外狼與家犬的雜交有關(guān)。

在之后的一些研究中也發(fā)現(xiàn)了黑狼表型在種群中的高頻率現(xiàn)象，如在20世紀(jì)40年代至21世紀(jì)初對賈斯帕國家公園及其周邊的狼的觀察中發(fā)現(xiàn)黑狼在種群中的頻率通常要高于50%，部分時段甚至可達到80%。同樣在黃石國家公園，黑狼在種群內(nèi)的頻率也非常高。

在2007年，有學(xué)者使用基因組連鎖掃描（genomewide linkage scan）的方法，對拉布拉多犬和靈緹犬雜交產(chǎn)生的黑色、虎斑色與黃色毛發(fā)的后代進行分析，并對多個標(biāo)記進行孟德爾遺傳規(guī)律的驗證，發(fā)現(xiàn)這些犬只的毛色轉(zhuǎn)換由K基因座控制，并得出了三種等位基因的顯隱性關(guān)系，即黑?(KB) >虎斑?(kbr) >?黃?(ky)。研究結(jié)果也將K基因座定位于家犬的16號染色體上，并且將KB突變映射到16號染色體遠(yuǎn)端遺傳標(biāo)記REN292N24和FH3592之間12 Mb間隔的區(qū)域。最后也提出了兩種K基因座作用模型 ：第一種是K基因是Agouti基因的上位基因并抑制后者的功能?；蛘咂洚a(chǎn)物作為Agouti mRNA表達的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制其表達?；蜃鳛榉g后抑制劑，降低?Mc1r（受體）處有活性的Agouti蛋白（胚體）的水平；第二種是K基因產(chǎn)物直接作用于MC1R，從而刺激真黑素信號通路的活性，間接抵消Agouti蛋白的作用。最終的結(jié)果都是促進真黑素合成，使家犬呈現(xiàn)黑色毛發(fā)。

同年，Candille等人的研究團隊基于生化和細(xì)胞實驗揭示了KB基因使家犬毛色變黑的分子機制。由于先前的研究已經(jīng)將KB突變定位到16號染色體的一個區(qū)間內(nèi)，學(xué)者使用基于連鎖的方法來縮小關(guān)鍵區(qū)間，并通過對成熟編碼區(qū)測序，發(fā)現(xiàn)了與KB基因相關(guān)的幾個多態(tài)性。在排除了其他基因已知的上位效應(yīng)對表型的影響后，他們發(fā)現(xiàn)第23位甘氨酸缺失與KB突變完全連鎖不平衡（一起遺傳），從而它們確定了KB突變的位置，這種CBD103的這種框內(nèi)缺失（CBD103ΔG23）正是KB突變。研究者還利用人工合成的CBD103和CBD103ΔG23蛋白去分別測試與Agouti與MC1R的互作，CBD103ΔG23能夠更有效地與Agouti蛋白競爭對Mc1r受體，從而有利于真黑素產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)家犬毛色。

到了2009年，Anderson等人的團隊發(fā)現(xiàn)KB突變也會導(dǎo)致狼的毛色呈現(xiàn)黑色，并發(fā)表了對KB等位基因的演化史的研究，他們通過對32只北極狼和15只無血緣關(guān)系的黃石狼以及12只家犬中的相關(guān)片段進行了測序并進行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)狼K基因座相關(guān)片段的連鎖不平衡模式與家犬相似，及它們的這個區(qū)域的遺傳結(jié)構(gòu)與演化史可能較為相似。擴展單倍型純合性（EHH）分析也表明KB經(jīng)歷過近期的選擇性清除（由于KB是有利突變，該突變受到正向選擇而趨于固定，而與之一起遺傳的中性位點也會隨著有利突變的固定而隨之固定下來，取代原有位點的多態(tài)性，因此在一段時間內(nèi)KB單倍型會呈現(xiàn)出高頻率，低遺傳多樣性的模式）。研究者還基于CBD103核心區(qū)構(gòu)建了一個簡易的鄰接樹，通過系統(tǒng)發(fā)育分析表明KB突變發(fā)生在單一物種中，隨后通過雜交出現(xiàn)在家犬、狼與郊狼身上。他們通過分子鐘的方法估計得該變體至少有約47000年的歷史（有95%的概率該突變發(fā)生在約13000～121000年間的某個時間點），并推測攜帶該變體的家犬隨著美洲原住民在約12000～14000年前到達北美，并在約500～14000年前通過與狼雜交將KB基因引入北美狼種群。學(xué)者還推測黑狼在森林地區(qū)有選擇優(yōu)勢，并認(rèn)為狼的毛色與其棲息地有很強的相關(guān)性。這種突變從家畜引入野生種群，并豐富了野生種群的基因庫，使野生種群能更好地適應(yīng)環(huán)境。

從事該研究的學(xué)者也提到相同的KB變體至少三次進入野生犬科動物種群，即進北美狼、意大利狼與郊狼，但黑色毛發(fā)喜馬拉雅狼的情況尚不明晰。但也有學(xué)者依據(jù)狼的捕獵習(xí)性認(rèn)為，由于狼是追逐型獵手，經(jīng)常活躍在開闊顯眼的地方追蹤獵物，并不依靠在夜間伏擊狩獵，因此所謂黑狼在森林中的隱蔽色可能不是對其生存有利的重要因素。20世紀(jì)人類對狼的狩獵活動中黑狼可能會更容易被發(fā)現(xiàn)從而受到選擇壓力。一些學(xué)者也提出苔原地區(qū)的黑狼在夏季可能會容易過熱，而白狼則更容易耐高溫（個人感覺腦洞大開了真是）。

一些學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該納入對美東地區(qū)犬科的研究來獲得更可靠的結(jié)論，他認(rèn)為KB還有可能源于北美東部地區(qū)的黑色犬科動物（Canis niger，C. rufus以及C. lycaon），并在威斯康星冰期（11000～18000年前）漸滲進入狼（C. lupus）體內(nèi)。而研究團隊回應(yīng)道這樣的研究最多只能豐富他們得出的結(jié)論，因為已經(jīng)有幾個獨立的證據(jù)表明家犬的KB比樣本狼的更古老，家犬的KB也有相對較高的多態(tài)性且在全球分布更廣，因此KB起源于美東地區(qū)類狼犬科動物并擴散到北美狼以及世界各地家犬中的假設(shè)是站不住腳的。

由于KB基因是一種有益突變，且KB單倍型在近期經(jīng)歷了選擇性清除，因此研究人員對其適應(yīng)性也產(chǎn)生了興趣。為了更好地理解該基因的功能和作用，研究人員進一步對KB基因進行了探究。先前提到有學(xué)者認(rèn)為黑色毛發(fā)可能作為在森林地區(qū)的一種隱蔽色，這個觀點在提出時就有人產(chǎn)生質(zhì)疑。一些學(xué)者則將注意力放在KB基因的多效性作用上，即KB基因所帶來的黑色毛發(fā)可能不會直接帶來適應(yīng)性優(yōu)勢，而是通過影響其他的表型來提供生存優(yōu)勢。

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2011年，Coulson等人的研究團隊將群體遺傳學(xué)與數(shù)學(xué)建模方法相結(jié)合，280只狼進行了采樣，使用積分投影模型（IPMs，廣泛應(yīng)用于生態(tài)學(xué)、演化生物學(xué)和自然資源管理等領(lǐng)域，應(yīng)用于預(yù)測種群動態(tài)、生活史策略、密度制約、環(huán)境過濾等方面）對黃石國家公園對狼展開生態(tài)學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜合黑狼（KB/ky）要比純合黑狼（KB/KB） 純合灰狼（ky/ky）有更高的年存活率與年繁殖率，也有更長的世代長度（母親到其后代的平均時間間隔），其終身繁殖成功率也是最高的。而純合黑狼（KB/KB）在各方面都是最差的，可能這也是該基因型頻率本身也非常低的原因，在種群中很罕見。其結(jié)果也說明黑色毛發(fā)可能并不會帶來直接的選擇優(yōu)勢，也與之前對隱蔽色的質(zhì)疑相呼應(yīng)。作者推測KB突變的選擇優(yōu)勢可能與該其他功能有關(guān)（即多效性），如KB突變可以在細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用。黃石國家公園的黑狼也存在著平衡選擇的現(xiàn)象（雜合子適合度最高，從而維持該基因座的多態(tài)性）。

2013年，Stahler等人利用長達14年的黃石國家公園狼長期研究數(shù)據(jù)，使用多變量混合效應(yīng)模型評估了狼本身不同性狀和生態(tài)因素對繁殖雌性灰狼的繁殖情況（產(chǎn)仔數(shù)和存活率）的相對影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灰色雌狼比黑色雌狼的繁殖成功率更高。雌性雜合黑狼的產(chǎn)下的幼崽年存活率比雌性純合灰狼要低25%。而KB又可能提高黑狼的免疫力。學(xué)者并將其解釋為免疫與繁殖投入的能量平衡/權(quán)衡（trade off），他們推測KB基因可能為雜合黑狼提供了更強的免疫力，而它們在免疫相關(guān)的能量投入的上升可能會增加撫養(yǎng)幼崽的成本。

在2014年，Hedrick等人使用Coulson團隊的數(shù)據(jù)，并根據(jù)假設(shè)適合度值，計算KB基因的預(yù)計頻率隨時間的變化，并與實際頻率進行比較。結(jié)果證明了雜合黑狼又很強的雜合優(yōu)勢，其適合度高于純合灰狼。作者也提到了黃石狼種群中存在負(fù)選型交配（即傾向選擇與自己表型不同的異性結(jié)為配偶，黑狼通常會與灰狼形成配偶）。同時作者也反駁了黑色毛發(fā)帶來的隱蔽性優(yōu)勢，也正如他在2009年對Anderson等人的研究提出的質(zhì)疑。

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2015年，對伊朗西部的黑狼進行了線粒體DNA、微衛(wèi)星以及形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)樣本中2只黑狼在過去的一代或兩代代中沒有雜交跡象。作者推測伊朗西部有黑色毛發(fā)的狼并不一定是近代與家犬雜交造成的基因污染的結(jié)果，可能是在野生狼中自然形成的，也有可能是與古代流浪狗雜交導(dǎo)致的。這與意大利的那些由于近期雜交而形成的黑狼不同（而在2004年一篇對一只意大利黑狼的微衛(wèi)星分析也得出了與這次伊朗狼相似的結(jié)論）。

在1995年至2015年在黃石國家公園記錄的狼的261次交配中，63.6%是灰狼和黑狼之間的交配。2016年Hedrick等人探究了黃石狼的負(fù)選型交配模式，他們首先分析了這21年間的交配數(shù)據(jù)，并提出了一個負(fù)選型交配模型，同時探討負(fù)選型交配的潛在影響，并將估計值與觀察值進行比較與分析。結(jié)果顯示在雜合優(yōu)勢的前提下，黃石狼的負(fù)選型交配可以更有力地解釋當(dāng)?shù)乩敲鄳B(tài)性維持的原因。并且通過與其他物種的數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)狼的負(fù)選型交配是哺乳動物中唯一被文獻記錄的案例，也是脊椎動物中唯一被記錄的自然發(fā)生的基因多態(tài)性案例。而這對于其他一些物種來說通常與基因倒位、人工選擇或環(huán)境因素有關(guān)，并不普遍。正是因為黃石國家公園的獨特性，使得在當(dāng)?shù)乜梢詫咏匀粻顟B(tài)的狼種群進行充分的生態(tài)觀察與種群監(jiān)測，才能得出這一結(jié)論。正如世界頂級狼專家大衛(wèi)·梅奇（L. David Mech）所說：“黃石公園是世界上觀察和研究狼的最佳地點”。

2017年，Cassidy等人通過對黃石國家公園中狼的個體行為觀察，對狼群之前的互動進行了評估，并將毛色納入分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑狼在與其他狼的攻擊性互動中表現(xiàn)出的攻擊性要低于灰狼，并且對皮質(zhì)醇的檢測結(jié)果表明灰狼的皮質(zhì)醇水平高于黑狼。結(jié)合先前對于家犬毛色與基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平的研究，學(xué)者推測K基因座的多效性會影響狼的皮質(zhì)醇激素分泌，降低黑狼糖皮質(zhì)激素，使得黑狼的基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平低于灰狼，進而影響到狼的行為。

由于2009年Anderson等人團隊的研究采樣比較有限，KB等位基因的演化史細(xì)節(jié)，如有從家犬到狼的引入事件到底有幾次、發(fā)生的時間和地理來源仍然未知。到了2018年，Schweizer等人設(shè)計了一個雜交捕獲陣列，對北美洲多個種群的狼和20個家犬品種進行了這些區(qū)域的測序，評估了核苷酸和單倍型多樣性模式、連鎖不平衡衰減以及種群間遺傳分化的層次模式，并評估了KB等位基因在每個種群樣本中的可能起源時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)K基因座受到選擇壓力，出現(xiàn)了強烈的選擇性清除跡象（有優(yōu)勢的KB在種群中趨于固定，周圍與其連鎖的一些SNP（單核苷酸多態(tài)性位點，包括中性位點）會通過搭車效應(yīng)隨之固定下來，取代原有的SNP位點，使含KB的單倍型遺傳多樣性下降，但頻率升高。由于KB沒有完全取代ky，表示KB純合可能有某種致死機制，該基因型的個體也非常罕見。對于K基因座的擴展單倍型純合性（EHH）分析顯示，相對于家犬，狼的KB單倍型有更廣泛的純合性，也符合選擇性清除的情況?；诜N群統(tǒng)計數(shù)據(jù)的結(jié)果顯示，育空地區(qū)狼種群的KB單倍型多樣性最高，其次是西北地區(qū)，而樣本量最大的黃石地區(qū)則是最低的（雖然這個從3個不同地區(qū)引入的種群在其他方面有較高的遺傳多樣性），顯示出育空和西北地區(qū)可能最接近引入事件發(fā)生的地點。而通過模型對等位基因頻率的推演卻排除了之前假設(shè)的KB基因的致死效應(yīng)，顯示KB純合個體數(shù)量少可能是自然選擇的結(jié)果?；贙B單倍型構(gòu)建的鄰接樹也顯示了北美狼中的KB等位基因的滲入只發(fā)生過一次（說明當(dāng)時人口少，家犬和狼互動機會少，只有一次引入事件傳播并流傳下來?；蛘咭胧澜绨l(fā)生過多次，只有一次得以流傳至今），而意大利狼中的KB基因相對于北美狼來說是獨立起源的。對于引入事件發(fā)生的時間都估計結(jié)果顯示，樣本種群中最古老的引入事件發(fā)生的約1598～7248年前的育空地區(qū)。因此唯一成功流傳下來KB等位基因引入事件可能發(fā)生在加拿大北極地區(qū)，此后迅速蔓延到整個大陸，使其他狼種群的KB單倍型多樣性降低。該事件是最近發(fā)生的，這是脊椎動物中已知的傳播速度最快的適應(yīng)性變體的之一，這可能與狼強大擴散能力有關(guān)。

由于K基因座蛋白是β-防御素家族抗菌肽的成員，基于先前對于CBD103的相關(guān)研究，人們對其多效性作用的推測大多數(shù)著眼于免疫。但KB等位基因?qū)τ诶敲庖叻矫娴木唧w影響仍然未知。先前的研究中發(fā)現(xiàn)了黃石國家公園K基因座處于平衡選擇狀態(tài)，并且當(dāng)?shù)厥橙饽课锓N密度很高，有眾多犬瘟熱等病毒等潛在宿主，易于在狼種群中傳播。于是在2021年，Johnston等人基于黃石國家公園犬瘟熱的流行情況，提出了狼KB等位基因通過影響整個轉(zhuǎn)錄組對病毒感染的基因表達反應(yīng)而對免疫力產(chǎn)生多效性的假設(shè)。他們先確定了北美狼中CBD103表達最高的組織和細(xì)胞類型，再用分子雜交檢測不同細(xì)胞的基因型，對ky/ky個體進行永生化處理，之后用CRISPR/Cas9技術(shù)將ky/ky中引入KB，建立KB/ky與ky/ky的細(xì)胞系。之后分別用聚胞嘧啶酸（polyI:C，TLR3的激動劑）與活的犬瘟熱病毒的反應(yīng)，通過轉(zhuǎn)錄組測序觀察基因表達情況。然而結(jié)果顯示不同基因型的細(xì)胞系中CBD103表達沒有明顯區(qū)別，實驗數(shù)據(jù)并沒有為CBD103基因型改變角質(zhì)細(xì)胞對polyI:C或CDV反應(yīng)的基因表達水平這一假設(shè)提供強有力的支持。研究者推測，CBD103基因型可能通過其他未知的機制影響免疫力，此次研究樣本也比較少，未來需要擴大樣本進行進一步研究。當(dāng)然，即使他們的假設(shè)成立，也可能因為體外細(xì)胞系的局限性而得不到結(jié)果（細(xì)胞系通常在培養(yǎng)皿中生長，缺乏活體環(huán)境中復(fù)雜的相互作用?？赡軙?dǎo)致細(xì)胞的生長和代謝方式不同于活體情況，從而產(chǎn)生偏差）。

在2013年，Ollivier等人對舊石器時代晚期（約公元前12000）的68只不同犬科動物（66只類狗形態(tài)，2只類狼形態(tài)）進行古DNA分析，發(fā)現(xiàn)約在公元前11000年～公元前8000年之間的歐洲家犬中就已經(jīng)存在。而在2022年Bergstr?m通過對多地的古代狼基因組進行測序，發(fā)現(xiàn)在14000前西伯利亞Tumat的一只古代狼（或者形態(tài)上接近狼狗雜交）中發(fā)現(xiàn)了CBD103三個堿基的缺失，且為雜合，很可能是黑色毛發(fā)的個體，這是迄今為止最早的關(guān)于CBD103 3bp缺失的證據(jù)。研究者認(rèn)為這個證據(jù)讓KB起源于狼的可能性提升，并且可能很早就在狼種群中低頻存在。但由于其年代（晚于家犬被馴化的時期）也不能排除KB起源于家犬，并通過雜交從家犬雜交滲入狼種群，當(dāng)然也不能排除KB突變可能有多次獨立起源（之前也提到過Schweizer等人在18年的研究中建立的K基因座NJ樹顯示意大利狼的KB和北美狼的KB是獨立起源的）。

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2022年，Cubaynes等人探究了黃石國家公園狼的毛色與犬瘟熱病毒爆發(fā)的關(guān)系。他們通過構(gòu)建模型來評估CDV對黑狼個體和種群水平的影響，并利用個體生活史和毛色數(shù)據(jù)對當(dāng)?shù)胤N群展開分析。結(jié)果顯示雖然沒有單一的證據(jù)可以直接證實“北美黑狼的頻率由CDV爆發(fā)的頻率決定”這一假設(shè)，但是多個證據(jù)線的綜合分析表明該假設(shè)可能是正確的。犬瘟熱爆發(fā)的頻率對狼的KB基因頻率產(chǎn)生了選擇壓力，但這種選擇壓力只在特定環(huán)境下才會有雜合優(yōu)勢（類似于人類鐮刀型細(xì)胞貧血癥，在瘧疾盛行的地方更容易生存，而在其他地區(qū)反之）。當(dāng)疾病流行時，雜合優(yōu)勢，非選型交配策略（即黑狼與灰狼傾向于互相配對）使得種群將有更高的平均適合度。

通過以上對于KB等位基因的研究，人們可以了解到KB等位基因的演化史，該變異可能源自于家犬，并隨著美洲原住民遷徙到北美之后通過雜交進入當(dāng)?shù)乩欠N群中，如今北美狼體內(nèi)的KB基因最可能源自數(shù)千年前北美西北部育空地區(qū)附近。而最近的研究證據(jù)顯示KB等位基因可能在14000年前的古代西伯利亞狼中就已經(jīng)存在。然而，關(guān)于KB基因究竟起源于狼還是家犬以及是否有多次獨立起源的問題，仍需要更多的研究來解答。此外，KB等位基因在狼種群中受到選擇壓力，并且出現(xiàn)了強烈的選擇性清除跡象。研究表明，KB等位基因可能與免疫力有關(guān)，但對于其在狼免疫方面的具體影響仍不明晰，需要進一步研究去探索。在研究過程中也發(fā)現(xiàn)了在黃石國家公園，狼種群的毛色與當(dāng)?shù)厝翢岬牧餍写嬖陉P(guān)聯(lián)，犬瘟熱病毒爆發(fā)可能對狼的KB基因頻率產(chǎn)生影響，但這種選擇壓力可能在特定環(huán)境下才會表現(xiàn)出雜合優(yōu)勢?？傮w來說，KB等位基因在狼和家犬中的演化和功能研究仍然在不斷深入。這些研究有助于我們更好地理解黑化狼的起源和適應(yīng)性優(yōu)勢，以及在自然環(huán)境中的演化過程。然而，仍然有許多未知因素需要進一步探索和證實。

白狼的毛色遺傳學(xué)與演化起源

除了對于黑色毛發(fā)的狼的相關(guān)研究，對于白色毛發(fā)狼的研究也得到了一些非常有趣的結(jié)果。

在2021年，Bannasch等人揭示了ASIP的遺傳變異是如何影響家犬的毛色著色模式。他們發(fā)現(xiàn)，Agouti的遺傳模式是由兩種模塊化啟動子引起的，即腹面啟動子（VP）異構(gòu)體和毛發(fā)周期啟動子（HCP）異構(gòu)體，這兩種異構(gòu)體組成的七種單倍型的不同排列組合方式對應(yīng)著五種毛色類型（具體機制可看前文）。研究團隊通過比較18只純合子狗（針對VP和HCP的結(jié)構(gòu)變異和編碼序列）和10只現(xiàn)代灰狼的單倍型。發(fā)現(xiàn)AG（VP2-HCP2）與灰狼相似，而DY（VP1-HCP1)與SY（VP2-HCP1)與埃爾斯米爾島與格陵蘭的北極狼單倍型相似。狼的白色被毛代表淺色的類黑素。北極狼的VP HCP64kb編碼序列中只有一個多態(tài)性位點，其他位點完全相同，而北極狼僅通過6個單核苷酸變異與DY單倍型進行區(qū)分。結(jié)果說明，沒有近期基因流動情況下，家犬的顯性黃色毛發(fā)（DY）與北極狼的毛色有共同起源。研究者又通過最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對家犬、灰狼和其他八個近源犬科物種進行了進一步的ASIP單倍型的演化起源研究。在VP樹中，所有的家犬和狼的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與物種本身的演化關(guān)系相對應(yīng)。但是HCP樹中，DY和SY的家犬與北狼聚在一個單獨的支系中。研究者確定了ASIP基因中VP和HCP的派生等位基因，派生等位基因HCP2在核心類狼物種（wolf-like，如狼、胡狼、郊狼、埃塞俄比亞狼等）中具有9個特定的SNV變異，而在DY家犬HCP1中沒有這些變異，這個單倍型中存在一段SINE插入（一種專座元件），這也就說明HCP1單倍型可能在200萬年以前其他類狼物種之前就存在了。VP1的歷史超過5萬年，而HCP1則有超過200萬年的歷史。則結(jié)果說明HCP1可能來源于已滅絕的犬科動物的幽靈血統(tǒng)，并在更新世晚期通過雜交引入到狼種群中。研究者將對?VP?和?HCP?單倍型的分析擴展到45只北美狼和23只歐亞狼，發(fā)現(xiàn)（VP1-HCP1）單倍型組合主要出現(xiàn)在北美北極地區(qū)，與白色被毛分布一致，歐亞地區(qū)沒有觀察到。還確定了一個祖先HCP1單倍型變體HCP1A， （VP2-HCP1A）組合存在于西藏內(nèi)蒙高海拔淺色狼中。（VP1-HCP1）單倍型組合主要出現(xiàn)在北美北極地區(qū)，與白色被毛分布一致，歐亞地區(qū)沒有觀察到。還確定了一個祖先HCP1單倍型變體HCP1A， （VP2-HCP1A）組合存在于西藏內(nèi)蒙高海拔毛色較淺的狼中。狼種群中的VP1?和?HCP1可能在擴散過程中通過與其他物種的基因交流獲得，由于適應(yīng)更新世與現(xiàn)代的北極環(huán)境而流傳下來，在塑造家犬和現(xiàn)代狼的遺傳多樣性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

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