2022 年 2 月，湖南大學(xué)于峰教授作為通訊作者，在 The EMBO Journal 雜志(IF: 11.598)在線發(fā)表了題為“”的研究論文，報道了轉(zhuǎn)錄因子 PHR1 通過調(diào)節(jié) RALF-FERONIA 受體激酶途徑，抑制植物免疫、招募有益微生物，進而促進植物磷吸收的分子機制。

湖南大學(xué)博士生唐靜和副教授伍斗生為論文第一作者。歐易生物在本研究中承擔(dān)了轉(zhuǎn)錄組測序及分析工作。

研究背景

磷是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，是限制世界范圍內(nèi)作物產(chǎn)量的主要因素之一。無機磷(Pi)是植物可吸收的磷的主要形式，但在土壤中濃度很低。

植物為了應(yīng)對缺磷環(huán)境、提高 Pi 吸收，常見策略包括改變根的形態(tài)和激活 Pi 饑餓相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，另一種策略是與一些微生物建立有益的共生關(guān)系。在磷酸鹽饑餓反應(yīng)(PSR)下，植物塑造根部微生物以緩解擬南芥中的 Pi 饑餓。

PHR1 是參與擬南芥 Pi 饑餓的主要轉(zhuǎn)錄因子，通過識別并結(jié)合 Pi 饑餓相關(guān)基因啟動子位點激活這些基因的表達。PHR1 還可以負(fù)向調(diào)節(jié)由細(xì)菌表位 flg22 觸發(fā)的免疫反應(yīng)。但 PHR1 介導(dǎo)的植物免疫抑制的分子途徑以及對該過程如何有利于植物緩解 Pi 饑餓的機制仍不清楚。

研究內(nèi)容

本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥 PHR1 直接與 RALF 基因的啟動子結(jié)合，并在 Pi 饑餓條件下激活它們的表達。RALFs 反過來通過 FERONIA 抑制病原體相關(guān)分子模式 (PAMP) 觸發(fā)的免疫 (PTI) 受體復(fù)合物形成，F(xiàn)ERONIA 是一個已報道的 PTI 調(diào)節(jié)基因，其突變可增加對某些有害微生物的抵抗力。通過 PHR1-RALF-FERONIA 軸抑制免疫，招募特定根際微生物群定殖并通過上調(diào) Pi 轉(zhuǎn)運基因的表達來幫助植物緩解低磷脅迫。本研究為環(huán)境擾動后通過調(diào)節(jié)植物先天免疫來協(xié)調(diào)宿主-微生物的平衡提供了一個新的范例。

研究結(jié)果

RALF-FER 參與低 Pi 脅迫介導(dǎo)的植物免疫抑制

RT-PCR 和 WB 實驗結(jié)果顯示，在 Pi 饑餓條件下，擬南芥根中一系列免疫指標(biāo)均受到持續(xù)抑制。已有研究表明，F(xiàn)ER 基因參與植物免疫調(diào)節(jié)。與野生型相比，在 Pi 饑餓條件下，突變體根系中免疫抑制幾乎消失（圖 A-C），表明 FER 是 Pi 饑餓介導(dǎo)的根系免疫抑制所必需的。

FER 是 RALF 的受體，F(xiàn)ER 和 RALF23 的結(jié)合會抑制由 PAMP 觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，外源施加 1μM RALF23 處理，會引起與 Pi 饑餓相似的免疫基因表達譜改變（圖 D-E）。進一步的 RALF23 過表達實驗證實（圖F-G），RALF23-FER 復(fù)合體參與了 Pi 饑餓引起的免疫抑制。

圖 | RALF-FER 參與低 Pi 脅迫介導(dǎo)的植物免疫抑制

PHR1 在 Pi 饑餓條件下靶向并激活 RALF 表達

WB 檢測顯示，在 Pi 饑餓條件下幼苗中 RALF23 成熟肽的蛋白含量顯著高于富磷條件下的幼苗，表明 Pi 饑餓可以促進 RALF23 成熟肽的積累（圖 A）。Pi 饑餓同樣可以促進其他 基因的表達（圖 B-C）。 基因啟動子中都含有 PHR1 的結(jié)合位點 P1BS（圖 D）。 突變體中 ?表達大都出現(xiàn)顯著下調(diào)（圖 E）。熒光素酶報告實驗、ChIP-qPCR、EMSA 證實 PHR1 可以直接結(jié)合到 RALF 啟動子中的 P1BS 位點（圖 F-G）。以上結(jié)果表明 PHR1 可以直接靶向并激活 ?的表達。

圖 | PHR1 在 Pi 饑餓條件下靶向并激活 RALF 表達

PHR1 介導(dǎo) RALF 激活通過抑制 FLS2-BAK1 復(fù)合體的形成以抑制 Pi 饑餓期的免疫

已有研究表明，RALF23 通過破壞 flg22 誘導(dǎo)的 FLS2-BAK1 復(fù)合體形成以抑制免疫反應(yīng)。免疫共沉淀結(jié)果顯示，與野生型相比，Pi 饑餓條件下 ?突變體中 flg22 誘導(dǎo)的 FLS2-BAK1復(fù)合物并未降低（圖 B-C），表明 PHR1 是 Pi 饑餓介導(dǎo)的免疫復(fù)合物抑制所必需的。

Pi 饑餓條件下 突變體中 flg22 誘導(dǎo)的 FLS2-BAK1復(fù)合物形成可被外源施加 RALF 抑制（圖 D-E）。而與野生型相比，無論富磷還是低磷條件下， 突變體中 flg22 誘導(dǎo)的 FLS2-BAK1復(fù)合物形成抑制均有明顯減輕（圖 F）。與野生型相比，在低磷條件下， 和突變體中均出現(xiàn)明顯免疫抑制（圖 G）。

以上結(jié)果表明，Pi 饑餓條件下 PHR1 通過激活 RALF 表達來抑制 PAMP 觸發(fā)的 FLS2-BAK1 復(fù)合物的形成，從而抑制植物免疫反應(yīng)。

圖 | PHR1 介導(dǎo) RALF 激活通過抑制 FLS2-BAK1 復(fù)合體的形成以抑制 Pi 饑餓期的免疫

低磷和 RALF23 處理促進根際細(xì)菌的定殖以協(xié)助植物抵抗低磷脅迫

培養(yǎng) 3 周后，對根際微生物群落組成進行檢測，結(jié)果顯示某些特定細(xì)菌的相對含量在低磷脅迫的野生型植株根際出現(xiàn)了明顯富集（圖 A, C, E, G）；同樣外源施加 RALF23 處理也可以富集與低磷處理相似的細(xì)菌類群（圖 B, D, F, H）；而 ?和 ?突變體中并未有明顯富集。表明 FER 和 PHR1 對于低磷條件下根際微生物群落結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用。

圖 | 低磷脅迫后細(xì)菌定殖分析及 處理后 RALF23 的釋放

進一步針對上述富集的細(xì)菌種類（以DC3000和 ?為代表）進行接種實驗，結(jié)果顯示，接種這 2 種細(xì)菌可以顯著增加野生型和 突變體的鮮重（圖 A-B），并上調(diào)根中 Pi 吸收相關(guān)基因的表達（圖 C）；但 ?突變體中并未觀測到此類現(xiàn)象。

以上結(jié)果表明，低磷和 RALF23 處理塑造了一種緩解 Pi 饑餓的特殊微生物群，而這種特殊微生物群用于緩解 Pi 饑餓的一種可能策略是誘導(dǎo) Pi 吸收基因的表達。

圖 | 細(xì)菌定殖可以緩解低磷壓力

突變體的根際微生物緩解了 Pi 饑餓

微生物多樣性測序顯示， 突變體與低磷處理的野生型，其富集根際微生物存在大量重疊（圖 A）。收集 3 周齡 突變體植株的根際微生物，接種到野生型和 突變體植株，可以顯著促進其生長（圖 B-C），表明 FER 的突變提供了一個有利于緩解 Pi 饑餓的根際微生物組。同時 qPCR 檢測顯示， 突變體植株的根際微生物接種可以顯著上調(diào) Pi 饑餓相關(guān)基因的表達（圖 D）。以上結(jié)果表明， 微生物組可以緩解 Pi 饑餓并誘導(dǎo) Pi 饑餓相關(guān)基因的表達。

圖 | ?根際微生物群在低磷條件下促進植株的生長

研究結(jié)論

本研究確定了一條 PHR1-RALFs-FER 通路，在擬南芥的 Pi 饑餓期間塑造根際微生物群。

本研究發(fā)現(xiàn)，協(xié)調(diào) Pi 饑餓和免疫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 PHR1，可以在低磷條件下直接靶向并激活幾個 RALF 基因的表達。PHR1 介導(dǎo)的 RALF 激活通過以 FER 依賴的方式抑制 PAMP 觸發(fā)的 FLS2-BAK1 復(fù)合物的形成來抑制植物免疫。在 Pi 饑餓期間抑制植物免疫有助于某些根際微生物的定殖，激活 Pi 轉(zhuǎn)運基因表達，緩解 Pi 饑餓。此外，來自 fer-4 突變體的微生物群顯著促進了植物生長，緩解了 Pi 饑餓。

總之，本研究揭示 PHR1-RALFs/FER-FLS2/BAK1一條新的信號通路，植物利用它來抑制免疫，塑造特定的根際微生物群，并緩解低磷條件下的 Pi 饑餓。

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