前言

2022年2月，中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院劉尊英教授課題組在《Foods》期刊發(fā)表的題為“Dissecting of the AI-2/LuxS Mediated Growth Characteristics and Bacteriostatic Ability of Lactiplantibacillus plantarum SS-128 by Integration of Transcriptomics and Metabolomics”的研究成果，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等研究方法，發(fā)現(xiàn)植物乳孢桿菌可以通過AI-2/luxs介導(dǎo)的群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)其生長特性和代謝，該系統(tǒng)是參與食品安全的正調(diào)控因子，這將有助于研究植物乳孢桿菌的生物保護(hù)控制潛力，特別是在食品工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。

中文標(biāo)題：通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的整合剖析植物乳桿菌 SS-128 的 AI-2/LuxS 介導(dǎo)的生長特性和抑菌能力

發(fā)表期刊：Foods

影響因子：4.350

作者單位：中國海洋大學(xué)

涉及的歐易/鹿明生物服務(wù)產(chǎn)品：轉(zhuǎn)錄組測序、GC-MS/LC-MS非靶向代謝組學(xué)

研究背景

乳酸菌(LAB)是自然界中安全且廣泛的微生物，主要用于發(fā)酵劑和益生菌。植物乳桿菌作為乳酸菌的一種，具有對復(fù)雜食物基質(zhì)環(huán)境的抗性，并能快速增殖，表明其具有較高的工業(yè)應(yīng)用潛力。與其他菌株不同，植物乳孢桿菌可以通過涉及cysK酶的直接巰基化從半胱氨酸合成同型半胱氨酸，以確保s-腺苷蛋氨酸(SAM)甲基的再生。由于cysK酶的獨特功能與luxS非常相似，從而推測它有助于提高植物乳桿菌的生長能力和抗逆性，因此通過了解AI-2/luxs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)對LAB的生長特性和抑菌能力的調(diào)控機(jī)制，為提高其生物保存功能提供依據(jù)。

研究思路

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實驗方法

研究材料：SS-128的luxS-突變體

1)AI-2試驗

2)細(xì)菌生長試驗

3)流式細(xì)胞術(shù)測定

4)抑菌能力的測定

5)轉(zhuǎn)錄組分析

6)非靶向GC-MS/LC-MS代謝組學(xué)分析

研究結(jié)果

luxS基因敲除的確認(rèn)

為了確認(rèn)luxS作為一種s-核糖體同型半胱氨酸裂解酶的功能，作者構(gòu)建了一個luxS的敲除突變體，然后利用生物發(fā)光法檢測植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128上清液中AI-2的水平。luxS基因編碼一種參與蛋氨酸代謝的酶，其缺失最終導(dǎo)致AI-2的缺失。如圖1c所示，植物乳桿菌SS-128的AI-2積累濃度在指數(shù)期后期達(dá)到最高水平，在穩(wěn)定期緩慢下降。此外，與結(jié)合轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析的?luxS/SS-128相比，SS-128的AI-2活性在14h時顯著增加(圖1d)。這些數(shù)據(jù)表明，luxS的缺失導(dǎo)致了AI-2合成的殘疾。

圖1 | SS-128和?luxS/SS-128中l(wèi)uxS基因的兩步同源重組、PCR擴(kuò)增、AI-2活性和luxS基因的轉(zhuǎn)錄

植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128的生長特性

植物乳桿菌通過生產(chǎn)主要由有機(jī)酸組成的抑菌化合物，在阻礙食品系統(tǒng)中的致病菌和腐敗菌的活性方面具有很大的潛力。因此，作者比較了無細(xì)胞上清液對植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128的大腸桿菌、波羅氏希瓦氏菌、金黃色葡萄球菌和約氏不動桿菌的抑菌能力(圖2d)。如圖2d所示，對照組沒有抑菌環(huán)，說明MRS肉湯對食源性腐敗和致病菌沒有抑菌能力。相比之下，SS-128在細(xì)菌周圍表現(xiàn)出一個清晰的抗菌環(huán)，并且在14h后大于?luxS/SS-128。特別是與?luxS/SS-128(15.18mm)相比，SS-128在24h時收集的CFS對波羅的海鏈球菌(16.41mm)具有顯著的抑菌活性(p<0.05)。通過上述結(jié)果可知，SS-128的代謝物具有較強(qiáng)的抑菌能力。

圖2?| 流式細(xì)胞術(shù)檢測植物細(xì)胞密度、活細(xì)胞數(shù)、VCP，以及SS-128和?luxS/SS-128對大腸桿菌、波羅的海、金黃色葡萄球菌和約氏氏菌的抑制區(qū)圖

植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128的體外抑菌作用

為了進(jìn)一步探討luxS基因?qū)χ参锶闂U菌產(chǎn)生的主要抑菌代謝物（有機(jī)酸）的調(diào)控作用，作者測定了植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128的有機(jī)酸產(chǎn)量。結(jié)果表明，敲除luxS基因后，植物乳桿菌SS-128的有機(jī)酸產(chǎn)量顯著降低(圖3a，b)。在12-16h內(nèi)，植物乳桿菌SS-128的乳酸產(chǎn)量比luxS突變型高20.96%~64.12%(p<0.05)(圖3a)。這些結(jié)果表明，植物乳孢桿菌中乳酸和PLA的產(chǎn)生可能與AI-2/LuxS系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。在作者的研究中，與?luxS/SS-128相比，SS-128在14h后的活菌數(shù)量較少，抑菌能力更強(qiáng)，這進(jìn)一步證實了luxS對植物乳桿菌生長特性和代謝的調(diào)控作用。圖3c顯示了培養(yǎng)8、10、12、14、16和24h后對植物乳桿菌中LDH活性的評價。與?luxS/SS-128(2.32mU/104細(xì)胞)相比，SS-128在10h后LDH活性顯著升高(4.25mU/104細(xì)胞)(p<0.05)。在指數(shù)生長期，SS-128的LDH活性保持穩(wěn)定，且顯著高于?luxS/SS-128(p<0.05)。

圖3| HPLC法檢測SS-128和?luxS/SS-128中l(wèi)-乳酸和PLA)的胞外濃度及LDH活性

植物乳桿菌SS-128和?luxS/SS-128的有機(jī)酸生產(chǎn)研究

探討AI-/luxs介導(dǎo)的QS與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平之間的關(guān)系是影響細(xì)菌代謝物積累的前提。作者通過識別無luxS基因的植物乳孢桿菌的表達(dá)譜，并對野生型和突變型進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。在PCA模型中，?luxS/SS-128和SS-128之間存在顯著性差異(圖4a)。第一主成分和第二主成分之間的差異分別為77.93%和11.78%。與不同水平表達(dá)的SS-128相比，在?luxS/SS-128中共鑒定出157個基因(p<0.05)(圖4b)。如圖4c所示，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，敲除luxS基因后一些通路發(fā)生了顯著的變化。

圖4 | PCA分析、火山圖和KEGG通路

植物乳桿菌SS-128與?luxS/SS-128的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

通過采用非靶向GC-MS和LC-MS代謝組學(xué)分析進(jìn)一步探討植物乳桿菌SS-128對luxS基因代謝過程的適應(yīng)性。GC-MS、LC-MS正離子模式和負(fù)離子模式在樣品中檢測到的代謝物總數(shù)分別為357、2316和1330個。圖5a中的野生型和突變型明顯分離。此外，OPLS-DA模型明確分離了第一主成分(PC)，各組間的差異分別為38.7%(GC-MS)和54.7%(LC-MS)。這些數(shù)據(jù)表明，由于luxS基因被敲除后，細(xì)胞代謝發(fā)生了顯著的變化(圖5b)。OPLS-DA模型篩選出了兩組中差異表達(dá)的代謝物。對GC-MS篩選出的110種代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其中26個代謝物顯著上調(diào)，84個代謝物顯著下調(diào)(p<0.05)(圖5c)。LC-MS共鑒定出464個差異表達(dá)的代謝物。

圖5| GC-MS比較luxS突變組與對照組的代謝物含量的變化

植物乳桿菌相關(guān)基因和代謝表達(dá)水平的變化

如圖6所示，l-半胱氨酸僅由丙酮酸維持，而其他相關(guān)代謝途徑的代謝物含量顯著降低。這種現(xiàn)象類似于漢斯·科恩伯格在《生物化學(xué)》中描述的“退化序列”，即一些關(guān)鍵的中間體在生長過程中被去除，其他相關(guān)的代謝物被用于中間體的凈生產(chǎn)。這與之前的研究結(jié)果一致，即與添加半胱氨酸的細(xì)胞相比，半胱氨酸缺乏的細(xì)胞表現(xiàn)出超過100倍的氧化應(yīng)激增加，并與細(xì)胞生長的保護(hù)機(jī)制有關(guān)。由于丙酮酸是連接碳水化合物或氨基酸的利用與能量生成和生物合成途徑的主要代謝連接點，因此關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物的含量需要通過輔助反應(yīng)及時補(bǔ)充。由于蛋氨酸循環(huán)的中斷，糖酵解和三羧酸循環(huán)被上調(diào)，以“維持”ATP的能量和NADPH的降低能量。與丙酮酸代謝和三羧酸循環(huán)相關(guān)的DEGs，如pckA、ME2、fumA和frdA，均表達(dá)上調(diào)。

圖6 | 植物乳桿菌相關(guān)基因和代謝表達(dá)水平的變化

研究結(jié)論

多組學(xué)分析表明，由于SS-128的丙酮酸代謝效率和能量輸入高于?luxS/SS-128，且其LDH水平等升高，導(dǎo)致其抑菌能力更強(qiáng)。AI-2/LuxS可以正向調(diào)控的抑菌活性和生長，所以SS-128可通過AI-2/luxS的介導(dǎo)從而提高食品安全，但仍需要進(jìn)一步研究探索。

小鹿推薦

LAB作為生物防腐劑潛力的科學(xué)研究一直引起了人們的關(guān)注。本篇文章利用菌株開發(fā)策略中涉及到的的非靶向GC-MS/LC-MS代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法比較SS-128及突變體丙酮酸代謝效率、LDH水平等，分析其抑菌能力可為提高食品的安全和質(zhì)量提供新的機(jī)會。

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