第1篇

聯(lián)合代謝組學和轉錄組學分析揭示了兩種砧木嫁接對'紐荷爾'臍橙果皮中酚酸調(diào)控機制的影響

期刊：Scientia Horticulturae

發(fā)表時間：2023年9月

單位：四川農(nóng)業(yè)大學

2023年8月，四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院在Scientia Horticulturae發(fā)表了題為“Combined metabolomic and transcriptomic analysis reveals variation in phenolic acids and regulatory networks in the peel of sweet orange ’Newhall’(C. sinensis) after grafting onto two different rootstocks”的研究論文。該研究利用代謝組和轉錄組分析比較了嫁接對“紐荷爾”臍橙果皮酚酸生物合成的影響，為柑橘果皮的有效利用提供了有價值的信息。邁維代謝提供了廣泛靶向代謝組和轉錄組檢測服務。

研究背景

“紐荷爾”臍橙屬于柑橘類水果，是全球消費最廣泛的水果之一。由于新鮮食品的消費占主導地位，廢棄的果皮不僅造成環(huán)境污染，而且造成寶貴資源的浪費。大量研究表明，柑橘果皮富含有益化合物，其中酚酸具有抗氧化等重要功效，柑橘果皮中酚酸生物合成的分子機制的理論研究較少，且不同砧木嫁接對酚酸生物合成的影響尚不清楚。

研究材料

選擇四川省涼山彝族自治州雷波縣金沙江河谷的臍橙果園作為實驗果園，試驗樹分別為嫁接在枳殼（ct）和香橙（cj）砧上的13年生“紐荷爾”臍橙樹。采集4個物候期（8月(ct1, cj1)、9月(ct2, cj2)、10月和11月(ct3, cj3)）果實。從每株樹的東南和西北方向，離地面1米左右，采集大小均勻、無病蟲害的果實。每個時期、每個處理分別選擇3株樹，每株樹采集4個果實（共12個果實）作為一個生物學重復，每個組三個生物學重復。將果皮與果肉分離，再用剪刀將果皮切成1mm的塊狀供后續(xù)使用。

研究思路

研究結果

作者首先評估了兩種嫁接方式下的4個時期果皮樣品（8月、9月、10月和11月）中的總酚酸含量。結果發(fā)現(xiàn)“紐荷爾”臍橙果皮的總酚酸含量受嫁接砧木和果實發(fā)育階段的顯著影響。ct在9月達到峰值(3427.27μg?g?1?FW)， cj在8月達到峰值(316.80μg?g?1?FW)，ct和cj的總酚酸含量變化趨勢完全相反。在10月份，雖然ct和cj之間存在差異，但差異小于其他三個時期，因此作者選擇8月，9月和11月進行代謝組學分析?？偣苍?8個樣本中檢測到270種酚酸，OPLS-DA結果顯示ct1與cj1、ct2與cj2、ct3與cj3之間存在顯著差異。利用Upset圖分析篩選出受時期影響的三種酚酸，此外，ct1與cj1共有12種酚酸，ct2與cj2共有47種酚酸，ct3與cj3共有14種酚酸。

代謝組數(shù)據(jù)分析和代謝物鑒定。(A) ct1與cj1、ct2與cj2、ct3與cj3的OPLS-DA圖；(B)組內(nèi)相關性圖；(C)Upset圖；(D) 韋恩圖

作者利用FC > 2 or < 0.5, p-value < 0.05 和 VIP>1進行各比較組中差異酚酸篩選。在ct1 vs cj1之間2種酚酸上調(diào)，3種下調(diào)。ct2 vs cj2中3種酚酸上調(diào)，10種下調(diào)。ct3 vs cj3中6種上調(diào)，6種下調(diào)。其中一種酚酸(3,4,5-Trimethoxycinnamic acid)在三個比較組中共有。4種酚酸（1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose, 4-O-(3 ′ -O-alpha-D-Glucopyranosyl)caffeoylquinic acid, 3-O-p-Coumaroylshikimic acid 和 Dunalianoside A）在兩個比較組之間共有。進一步分析五種酚酸的相對含量。在cj1中未檢出3,4,5-Trimethoxycinnamic acid，而在ct1中含量較高。同樣，在ct3中未檢測到1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose。4-O-(3 ′ -O-alpha-D-Glucopyranosyl) caffeoylquinic acid 和 3-O-p-Coumaroylshikimic acid的變化趨勢與總酚酸含量在ct和cj之間的變化趨勢一致。這24種差異累積的酚酸可能是ct和cj之間總酚酸含量顯著差異的原因。

ct和cj果皮中酚酸的差異分析。(A-C) 差異條形圖；(D) 4種酚酸在ct和cj之間不同發(fā)育階段相對含量的Log2值柱形圖

轉錄組結果表明，8 ~ 11月差異基因總數(shù)最多，分別為ct (ct1 vs ct3) 5932個和cj (cj1 vs cj3) 4741個。其中，8 - 9月ct和cj之間差異基因數(shù)105個(3741和3636)，8 - 11月差異基因數(shù)1191個(5932和4741)，9 - 11月差異基因數(shù)1608個(3621和2013)。這些結果表明，不同的發(fā)育階段和砧木嫁接對基因表達水平有影響。在所有差異基因中，鑒定出36個富集酚酸生物合成途徑的結構基因，包括4個CsPALs、2個CsC4Hs、6個Cs4CLs、8個CsCSEs、8個CsCOMTs和8個CsHSTs。利用熱圖分析這36個結構基因的基因表達水平。在4個CsPALs家族成員中，3個CsPALs表現(xiàn)出相似的基因表達水平，而一個CsPAL (Cs_ont_7g006400)表現(xiàn)出顯著差異，該基因在cj1中的表達高于ct1，但在ct2和ct3中的表達分別高于cj2和cj3。這與總酚酸含量的變化趨勢一致。此外，7個結構基因（Cs_ont_9g025750, Cs_ont_1g004990, Cs_ont_3g008120, Cs_ont_5g017430, novel.756, Cs_ont_6g004010, Cs_ont_7g004590）與總酚酸含量在ct和cj 3個不同時期的變化趨勢保持一致。

酚酸合成途徑及結構基因表達量熱圖

為了研究砧木嫁接對酚酸生物合成的影響，作者計算了24種不同的酚酸與36個結構基因之間的相關性。在ct1 vs cj1中，5種酚酸與31個基因表現(xiàn)出很強的相關性。在ct2 vs cj2中，13種酚酸與20個結構基因顯著相關。在ct3 vs cj3中，12種酚酸與26個結構基因顯著相關。這24種差異酚酸其中4種（ct1 vs cj1），10種（ct2 vs cj2），6種（ct3 vs cj3）表現(xiàn)出與總酚酸含量相同的變化趨勢。其中，2,5-Dibenzoylglucaric acid僅與兩個結構基因呈正相關，而sinapoylglucuronic acid和3-O-p-Coumaroylshikimic acid與大多數(shù)結構基因的表達水平呈正相關，其中包括一個CsPAL基因和一個Cs4CL基因。在cj中鑒定了33個與酚酸合成密切相關的結構基因。對ct和cj進行了三個時期的兩兩比較，以確定調(diào)節(jié)酚酸生物合成的轉錄因子。在六個比較組(ct1 vs ct2, ct1 vs ct3, ct2 vs ct3, cj1 vs cj2, cj1 vs cj3, cj2 vs cj3)中分別鑒定了228、378、227、269、325和125個差異轉錄因子。對ct1 vs ct3中378個TF的前5位家族成員進行分析，結果發(fā)現(xiàn)AP2/ERF-ERF家族成員最多，其次是bHLHs、MYBs、NACs和WRKYs，共有134個TFs。在cj1 vs cj3中，下調(diào)的轉錄因子數(shù)量也高于上調(diào)的轉錄因子數(shù)量。這與cj1 vs cj3總酚酸含量的趨勢一致。進一步對325個轉錄因子進行了分類，發(fā)現(xiàn)前5個轉錄因子家族占轉錄因子總數(shù)的36%。轉錄因子成員數(shù)量最多的家族仍然是AP2/ERF-ERF。其余4個家族分別為GRASs、C2H2s、NACs和bHLHs。此外，ct2 vs ct3中差異轉錄因子的數(shù)量遠高于cj2 vs cj3。在ct1 vs cj1中，篩選出54個差異轉錄因子，其中AP2/ERF-ERF 12個，其次是MYBs(5個)和NACs(5個)家族成員。在ct2與cj2中，鑒定出67個轉錄因子，差異轉錄因子數(shù)量最多的家族也是AP2/ERF-ERFs(16個)，其次是C2H2s(7個)、NACs(6個)和LOBs(6個)。在ct3與cj3中，鑒定出99個差異轉錄因子，AP2/ERF-ERFs(17個)，其次是MYBs(13個)、bHLHs(8個)、C2C2-Dofs(7個)和WRKYs(6個)家族。

不同酚酸與結構基因的關系圖。(A) ct1與cj1、ct2與cj2、ct3與cj3的和弦圖；(B)不同酚酸相對含量的Log2值柱形圖

通過共表達網(wǎng)絡來確定酚酸生物合成的調(diào)控機制。在ct1和cj1中共表達了5種酚酸和54種TFs，發(fā)現(xiàn)了9個AP2/ERF-ERF家族成員和5個MYB家族成員。其中，3-O-p-Coumaroyl shikimic acid，1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose，(3-Mustard acyl)-fructosyl- α -D-(6-mustard acyl)gluco-side與4個轉錄因子ERF23、EF109、ERF14和MY102呈顯著正相關，與2-Feruloyl-sn-glycerol，3,4,5-Trimethoxycinnamic acid.呈顯著負相關。8個MYB和1個AP2/ERF-ERF家族成員與2-Feruloyl-sn-glycerol和3,4,5-Trimethoxy-cinnamic acid呈顯著正相關，與3-O-p-Coumaroylshikimic acid，1-O-Galloyl-2-O-p-Coumaroyl-β-D-glucose，(3-Mustard acyl)-fructosyl-α-D-(6-mustard acyl)glucoside呈顯著負相關。此外，作者對ct2和cj2進行了相同的分析，發(fā)現(xiàn)12個AP2/ERF-ERF家族成員和3個MYB與13種差異酚酸顯著相關。在ct3與cj3的共表達中，發(fā)現(xiàn)11個AP2/ERF-ERF家族成員和13個MYB家族成員與12種差異酚酸顯著相關。這24個差異轉錄因子被分為兩類，其中6個差異轉錄因子與6種差異酚酸呈正相關。其余7個MYB和10個AP2/ERF-ERF家族成員與6種差異酚酸正相關。篩選與發(fā)育時間相關的轉錄因子，59個差異轉錄因子存在于ct的所有時期，36個差異轉錄因子存在于cj的三個時期。在ct和cj中存在3個共有差異酚酸與轉錄因子顯著相關。這些轉錄因子可能是影響酚酸差異合成的潛在轉錄因子。為了驗證轉錄數(shù)據(jù)的可用性，隨機選擇了20個基因進行qRT-PCR分析。結果顯示，大部分基因的相對表達水平與轉錄組結果一致，證明了轉錄組數(shù)據(jù)的準確性。

“紐荷爾”臍橙果皮酚酸生物合成的假設模型圖

第2篇

結合代謝組學和轉錄組學分析嫁接對'紐荷爾'臍橙果皮中類黃酮生物合成的影響

期刊：frontiers in plant science

發(fā)表時間：2023年7月

單位：四川農(nóng)業(yè)大學

2023年7月，四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院在frontiers in plant science發(fā)表了題為“Hetero-grafting affects flavonoid biosynthesis in sweet orange 'Newhall' (Citrus sinensis) peels: a metabolomics and transcriptomics analysis”的研究論文。該研究利用廣泛靶向代謝組以及轉錄組比較分析了不同嫁接方式對“紐荷爾”臍橙果皮中類黃酮生物合成的影響，為柑橘嫁接的應用價值和促進柑橘營養(yǎng)類黃酮成分的積累提供了新的視角。邁維代謝提供了廣泛靶向代謝組以及代謝組檢測服務。

研究背景

嫁接技術被廣泛運用在柑橘栽培種植中，不同砧木嫁接對柑橘的生長發(fā)育、果實品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生重要影響。然而，研究者對不同砧木嫁接后柑橘果皮中黃酮類化合物的合成影響了解有限。

研究材料

選擇中國涼山州雷波縣金沙江旁一株13年樹齡的“紐荷爾”臍橙樹嫁接在枳（ct）和香橙（cj）上作為樣本。每個接穗-砧木組合的柑橘樣品在果實膨大期(開花后150天)、果實膨大后期(開花后180天)、果實轉色期(開花后210天)和果實成熟期(開花后240天)4個階段采集。每個組三個生物學重復。

研究思路

研究結果

ct和cj樣本中的總類黃酮含量從150DAF的 (1692.42 μg/g, 1337.38 μg/g)增加到180DAF 的(2317.67 μg/g, 1791.67 μg/g)，在180DAF達到峰值。在210DAF時，ct和cj樣本中的總類黃酮含量沒有顯著差異。在150DAF、180DAF和240DAF時，ct樣本中的總類黃酮含量顯著高于cj。因此作者選擇150DAF (ct1, cj1)、180DAF (ct2, cj2)和240DAF (ct3, cj3)樣品進行類黃酮代謝組分析，共檢出703種類黃酮。其中ct2和cj2差異顯著，這與總類黃酮含量變化趨勢一致。703個類黃酮被分為8類，其中黃酮占總類黃酮的比例最高(380,54.1%)，其次是黃酮醇(157,22.3%)和黃酮類(64,9.1%)。熱圖分析顯示，查爾酮、黃酮、黃烷醇、黃酮醇和其他類黃酮對ct1有顯著貢獻。查爾酮、二氫黃酮醇、黃烷酮和黃烷醇導致ct2中總類黃酮含量高于cj2，而ct3中僅黃酮和黃烷醇對總類黃酮含量有主要貢獻。分析表明，黃酮類化合物可能是導致ct和cj果皮總類黃酮含量差異的最重要的類黃酮化合物。采用FC＞2或＜0.5來確定DAFlv，采用韋恩圖說明DAFlv在六組中的分布。ct2 vs cj2存在123個DAFlvs，與ct1 vs cj1(19個)和ct3 vs cj3(94個)相比，DAFlvs數(shù)量最多。對這123個DAFlvs進行分析，其中黃酮(72)、黃酮醇(17)和黃烷酮(12)的含量最多。而8個類中DAFlvs的數(shù)量與總類黃酮含量沒有相關性。ct2 vs cj2、ct3 vs cj3、ct2 vs cj2和ct3 vs cj3、ct1 vs cj1、ct1 vs cj1和ct3 vs cj3、ct1 vs cj1和ct2 vs cj2分別鑒定出92、61、24、7、5和3種類黃酮化合物。3個比較組中（ct1 vs cj1、ct2 vs cj2、ct3 vs cj3）均存在4種類黃酮化合物(3,4’-Dihydroxyflavone，Chrysoeriol-7-O-(6’’-feruloyl)glucoside，Cirsimaritin 5-[6’’-(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl)Glucoside]，和Tricin-7-O-(2’’-Sinapoyl)glucuronide)，表明它們受到不同砧木嫁接的影響。此外，在不同發(fā)育階段之間進行兩兩比較。6個比較組中共有21種類黃酮化合物，包括15種黃酮類化合物、2種黃酮醇類化合物、2種其他類黃酮化合物、1種黃烷酮類化合物和1種異黃酮類化合物，說明它們受不同發(fā)育時期的影響顯著。這25種類黃酮化合物用于后續(xù)分析。

ct和cj果皮類黃酮代謝組分析。(A)主成分分析；(B)組內(nèi)組間相關性分析；(C) ct和cj果皮中703個類黃酮的分類和比例。(D) ct和cj果皮中8類黃酮類化合物在3個發(fā)育時期的熱圖

對18個樣品進行RNA-seq分析。在三個發(fā)育階段使用韋恩圖來識別DEGs，使用| log2(fold change) | > 1和FDR < 0.05篩選比較組的DEGs。結果顯示，ct1 vs ct3共有882個DEGs, cj1 vs cj3共有524個DEGs，表明這些DEGs是導致ct果皮中總類黃酮含量增加的原因。K-means聚類分析表明，所有DEGs被分為7類，第2類、第4類、第5類、第6類和第7類DEGs表達趨勢與ct和cj果皮中總類黃酮含量一致，其可能含有影響ct和cj果皮之間類黃酮生物合成的基因?；贙EGG富集和GO功能分析，本研究鑒定出38個編碼類黃酮生物合成酶的基因，這些基因包括2個CHS基因、1個CHI基因、3個FNS基因、9個IF基因、1個F3’H基因、8個F3’H基因、1個F3’5’H基因、7個FLS基因、1個LAR基因、1個ANR基因和4個ANR基因。作者比較了ct和cj之間25種黃酮類化合物的相對含量。ct1 vs cj1中，有6個類黃酮化合物增加，17個類黃酮化合物減少，而ct2 vs cj2中，分別有13和12個類黃酮化合物上調(diào)和下調(diào)，ct3 vs cj3中，有14種類黃酮化合物增加，9種類黃酮化合物減少。表明類黃酮化合物的含量在不同的比較中呈現(xiàn)出不同的趨勢。

DEGs富集途徑及表達模式分析。(A) ct和cj果皮中DEGs的韋恩圖；(B) DEGs的K-means圖；(C) ct和cj中DEGs的GO富集圖；(D) ct和cj中DEGs的KEGG富集圖

采用Pearson相關分析對生物合成途徑中38個候選基因的表達水平與類黃酮含量進行分析。結果表明，1個CHS 基因 (CHSY)、1個CHI 基因(FAP3)、3個FNS 基因 (C93B2、2C9B16)和1個FLS 基因 (IDS3)與1種黃酮、1種黃酮醇和多數(shù)黃酮顯著相關。兩點圖顯示CHS基因(Cs_ont_3g009610)與FLS基因(Cs_ont_5g025740)表現(xiàn)出相同的趨勢，CHI基因(Cs_ont_5g033840)與兩個FNS基因(Cs_ont_5g024870, Cs_ont_5g024890)表現(xiàn)出相似的趨勢。結果表明，6個基因?qū)︻慄S酮化合物的生物合成具有重要調(diào)控作用，尤其是黃酮類化合物。為研究TFs調(diào)控ct和cj果皮中6個樞紐結構基因的差異積累，作者進一步分析了TF編碼基因的轉錄本。共鑒定出1887個TFs，643個差異表達。其中，1個TF被注釋到類黃酮生物合成途徑上，447個未被KEGG、NR、Swissprot、sway、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫注釋，表明這448個TFs可能調(diào)控DAFlvs。排名前10位的TF家族有249個差異表達TFs，包括AP2/ERF-ERF、NAC、MYB、C2H2、MYB-related、C2C2-Dof、LOB、B3、HB-HD-ZIP等。作者評估了6個樞紐結構基因在ct和cj果皮中與249個差異表達的TFs之間的類黃酮生物合成調(diào)控網(wǎng)絡。在調(diào)控網(wǎng)絡中，CHS基因與3個TFs正相關，包括1個AP2/ERF-ERF 轉錄因子(CsDREB3)。5個TFs (2個CsEF114、CsERF03、CsMYB06和CsMYB102)與FLS結構基因呈正相關，1個TF與FLS結構基因呈負相關。此外，11個TFs (CsEF105、2CsAS1、CsDREB3、CsEF119、CsMYB17、CsERF39、CsEF106、cserf24、CsERF35和CsERF23)與C9B16(FNS、Cs_ont_5g024870)呈正相關，5個TFs (CsMYB10、CsAS1、CsDREB3、CsEF106和CsRAP24)與C93B2 (FNS)呈正相關。2個TFs與C9B16 (FNS, Cs_ont_5g024890) 呈負相關，只有1個TF與C9B16呈正相關。以上結果表明，上述19個TFs可調(diào)控相關結構基因的表達，導致類黃酮化合物的差異性積累。最后，作者對上述6個結構基因和19個TFs進行了qRT-PCR，結果顯示了轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。

ct和cj果皮類黃酮生物合成途徑。(A)類黃酮生物合成通路熱圖；(B) ct和cj中25種類黃酮化合物在三個時期的含量分布

不同砧木嫁接“紐荷爾”臍橙果皮類黃酮化合物、結構基因和TFs參與類黃酮化合物生物合成的假設模型圖

第3篇

轉錄組和UPLC-MS/MS揭示不同砧木嫁接后'紐荷爾'臍橙氨基酸生物合成機制

期刊：frontiers in plant science

發(fā)表時間：2023年7月

單位：四川農(nóng)業(yè)大學

2023年7月，四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院在frontiers in plant science發(fā)表了題為“Transcriptome and UPLC-MS/MS reveal mechanisms of amino acid biosynthesis in sweet orange ‘Newhall’ after different rootstocks grafting”的研究論文。該研究基于轉錄組同時結合氨基酸含量變化研究了不同砧木嫁接后“紐荷爾”臍橙氨基酸生物合成機制，該研究結果進一步強調(diào)了砧木選擇在提高柑橘類水果營養(yǎng)價值方面的重要性，并可能有助于功能性柑橘類食品和營養(yǎng)氨基酸補充劑的開發(fā)。邁維代謝提供了廣泛靶向代謝組和轉錄組檢測服務。

研究背景

嫁接在柑橘生產(chǎn)中很常見。不同砧木類型直接影響柑橘的果實品質(zhì)和營養(yǎng)風味。然而，通過不同砧木嫁接對柑橘代謝產(chǎn)物的影響研究非常有限，特別是氨基酸（AA）。初步試驗表明，兩種砧木（枳（CT）和香橙（CJ））嫁接后的總氨基酸含量存在顯著差異。CJ嫁接后，果皮總氨基酸含量高于果肉。然而，影響氨基酸差異積累的分子機制仍不清楚。

研究材料

13年樹齡的“紐荷爾”臍橙樹嫁接在枳（CT）和香橙（CJ）上作為樣本。每個接穗-砧木組合的柑橘樣品在果實膨大期(開花后150天)（CT1，CJ1）、果實膨大后期(開花后180天) （CT2，CJ2）、果實轉色期(開花后210天) （CTT，CJJ）和果實成熟期(開花后240天) （CT3，CJ3）4個階段采集。每個組三個生物學重復。

研究思路

研究結果

在成熟過程中，CT和CJ之間總氨基酸含量差異顯著。幼果期和膨大期CJ總氨基酸含量顯著高于CT，而果實成熟期CT總氨基酸含量高于CJ。選擇三個發(fā)育階段（90DAF、150DAF和240DAF）進行UPLC-MS/MS 分析。PCA，OPLS-DA分析顯示樣本和不同發(fā)育階段之間的差異顯著?？偣茶b定出110種氨基酸及其衍生物，其中包括5種必需氨基酸，首次發(fā)現(xiàn)柑橘中含有大量氨基酸。HCA 將 110 個 AA 分為三組。簇I由31種AA組成，在果實膨大期的CT和CJ果皮中含量較低，包括 L-同型半胱氨酸。Cluster II 包含34個AA，包括L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸和L-蛋氨酸。聚類III包括45個 AA，主要集中在果實幼期。總體趨勢表明，CT和CJ果皮的氨基酸含量從幼果期到果實膨大期呈上升趨勢，然后從果實膨大期到果實成熟期下降，這與總氨基酸含量一致。在這110種氨基酸中，5種是必需氨基酸，其中L-纈氨酸在90 DAF中含量最高，但L-苯丙氨酸在210 DAF和240 DAF中含量最高。柱形圖分析顯示，CT1 vs CT2、CT1 vs CT3 和 CT2 vs CT3 中分別存在 42，57，46個DAA。同樣，在 CJ1 vs CJ2、CJ1 vs CJ3 以及 CJ2 vs CJ3 中分別鑒定出 46、49 和 44 個 DAA。作者發(fā)現(xiàn) 11 種 DAA 很常見，并且其含量在 6 個比較組中存在顯著差異，表明生物合成這些AA的比例受到發(fā)育階段的影響。六種氨基酸（S-甲基-L-半胱氨酸、L-正亮氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、3,4-二羥基-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸-纈氨酸）含量在8月份達到峰值，表明這些氨基酸對果實膨大期總氨基酸含量貢獻較高。另外，3,4-二羥基-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸-纈氨酸在6月份未檢出，8月份含量達到高峰，直至果實成熟階段含量下降。

不同發(fā)育階段和不同砧木嫁接對20種AA的影響。(A)不同發(fā)育期對11種AAs含量變化的影響；(B)不同砧木嫁接對CT1 vs CJ1、CT2 vs CJ2、CT3 vs CJ3中10個AA的log2 FC值的影響

在 CT 和 CJ的三個時期內(nèi)總共檢測到 9,681 個 DEG，并且這些基因被分為三個亞類：亞類1(2,963DEG)、亞類2(3,729DEG)和亞類3(2,989DEG)。DEGs模式與亞類2中的總氨基酸含量一致。此外， KOG功能分類顯示 564個基因參與氨基酸轉運和代謝。為進一步研究這些 DEG 的變化，繪制維恩圖和火山圖。對這些DEG進行KEGG 和 GO 分析。KEGG氣泡圖顯示，與氨基酸生物合成相關的多種途徑在CT和CJ中顯著富集。CT2 vs CT3 以及 CJ2 vs CJ3 相比，代謝途徑、碳代謝、糖酵解或糖異生、光合作用、氨基酸生物合成和檸檬酸循環(huán)顯著富集。作者繪制了氨基酸生物合成途徑，篩選了17個與氨基酸合成相關的基因，并分析了CT和CJ果皮的氨基酸含量與結構基因的相關性。基因表達水平熱圖顯示了 CT 和 CJ 果皮中結構基因的不同表達模式。CT 和 CJ 果皮中 L-同型半胱氨酸、L-組氨酸、L-鳥氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸和 L-纈氨酸含量均下降。相應地，D-3-磷酸甘油酸脫氫酶核糖-5-磷酸異構酶（RPI）、半胱氨酸合酶（CYSK）、天冬氨酸轉氨酶（AAT）、丙酮酸激酶（PK）和天冬酰胺合成酶（ASNS）也減少了。隨著CT1 vs CT2、CJ2 vs CJ3中RPI表達降低，L-組氨酸含量降低。類似地，當CJ1 vs CJ2中組氨醇脫氫酶( HIS )的表達水平降低時，L-組氨酸含量降低。L-纈氨酸含量隨著丙酮酸激酶（ PK）和支鏈氨基酸轉氨酶（BCAT）表達的增加而降低。相反，當分支酸變位酶（CM）的表達水平增加時，L-苯丙氨酸積累，而當預苯酸脫氫酶（TYRA）的表達水平增加時，L-酪氨酸減少等等。除少數(shù)例外，大多數(shù)氨基酸含量與結構基因的表達模式相對應。氨基酸生物合成途徑清楚地揭示了氨基酸含量與結構基因之間的聯(lián)系，這為進一步研究CT和CJ果皮的氨基酸生物合成奠定了基礎。

CT和CJ果皮氨基酸合成途徑。(A) CT和CJ不同成熟期主要氨基酸含量分布；(B) CT和CJ不同成熟期氨基酸合成相關基因的表達譜；(C)氨基酸生物合成途徑中結構基因與代謝物合成關系圖

作者通過柑橘皮氨基酸含量和結構基因的組間相關分析，研究了參與氨基酸生物合成的樞紐基因。結果顯示，CT中L-賴氨酸、L-蛋氨酸和L-色氨酸與CM呈正相關，但L-苯丙氨酸與大多數(shù)基因表達呈正相關。相反，L-同型半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸和L-鳥氨酸與SERA、METE、ACO、ASSY、CYSK、HIS、AK的表達呈負相關。RPI基因表達水平與CJ中大部分AA相關，推測RPI在CJ的氨基酸生物合成中比在CT中發(fā)揮更關鍵作用。L-苯丙氨酸與CM表達顯著相關。BCAT、SERA、METE、TYRA、ACO、PK、AK和PFK基因表達與L-胱氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸和L-鳥氨酸呈負相關。在本研究中，使用13種氨基酸含量和與氨基酸生物合成途徑相關的19個結構基因的表達水平進行RDA分析。RDA結果顯示，結構基因的表達水平在CT和CJ中的貢獻率分別占96.76%和95.24%。此外，結果顯示樣品之間存在明顯差異，表明不同砧木嫁接和發(fā)育階段顯著影響氨基酸生物合成。在CT中，CM的表達水平與L-天冬酰胺、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸和L-苯丙氨酸顯著相關。然而，CJ中基因表達水平與前述AA含量之間沒有顯著相關性?？偟膩碚f，結果表明CM、RPI、BCAT、SERA、METE和ACO在“紐荷爾”臍橙果皮的氨基酸生物合成中發(fā)揮著重要作用，突出了它們在柑橘發(fā)育過程中氨基酸積累的重要性。

氨基酸生物合成途徑中氨基酸與合成基因的相關分析（A, B）和冗余分析RDA分析（C, D）

本研究通過共表達網(wǎng)絡結合代謝譜來識別 CT 和 CJ 果皮的樞紐基因。對不同模塊和性狀進行相關性分析，以尋找與氨基酸生物合成相關的基因簇。其中brown模塊與大多數(shù)AA表現(xiàn)出較高的相關系數(shù)。值得注意的是，brown模塊中的大多數(shù)基因在幼果期的表達水平高于果實膨大期，然后在果實膨大期與果實成熟期的表達水平降低。這一趨勢與總氨基酸含量變化一致。因此，選擇brown模塊進一步篩選hub基因。在brown模塊中，鑒定出9個結構基因，分別是CsPFKA2（Cs_ont_2g000110）、CsRPI4（Cs_ont_2g008890）、CsRER6（Cs_ont_7g002290 ）、CsBCAT2（Cs_ont_8g027050）、CsBCAT6（Cs_ont_8g027100）、CsAAT1 (Cs_ont_6g013390)、 CsAAT3 (Cs_ont_4g003990)、CsTSJT1 (Cs_ont_2g005360 ) ）和CsASNS1 (Cs_ont_8g000470)。使用brown模塊中的九個結構基因和轉錄因子（TF）構建共表達網(wǎng)絡。在共表達網(wǎng)絡中鑒定出41個與至少7個結構基因高度相關的TF，其中包括 5 個NAC、4 個AP2/ERF-ERF、3 個MYB、2 個bHLH、2 個bZIP、2 個HB-HD-ZIP、2 個FAR1、2個HSF、2 個SBP、1 個WRKY、1 個PLATZ、1 個C2C2 ->C2C2-Dof1，一個C2C2，一個C3H。其中，12個TF與8個結構基因相關。因此，9個結構基因和12個轉錄因子可能在CT和CJ果皮的氨基酸生物合成中發(fā)揮重要作用。此外，通過qRT-PCR分析了這21個基因的表達模式。除少數(shù)例外，這些基因的相對表達水平與RNA-seq中的FPKM值基本一致，表明轉錄組數(shù)據(jù)整體的可靠性。

brown模塊中結構基因與tf的共表達網(wǎng)絡

砧木嫁接對AAs差異生物合成影響的模型圖

第4篇

廣泛靶向代謝組學與轉錄組分析相結合揭示了鎂脅迫對'紐荷爾'臍橙中類黃酮的生物合成的影響

期刊：frontiers in plant science

發(fā)表時間：2023年5月

單位：四川農(nóng)業(yè)大學

2023年5月，四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院在frontiers in plant science發(fā)表了題為“Widely targeted metabolomics profiling combined with transcriptome analysis sheds light on flavonoid biosynthesis in sweet orange 'Newhall' (C.sinensis) under magnesium stress”的研究論文。該研究綜合廣泛靶向代謝組學與轉錄組分析揭示了鎂脅迫對“紐荷爾”臍橙中類黃酮的生物合成的影響。邁維代謝提供了廣泛靶向代謝組以及轉錄組檢測服務。

研究背景

“紐荷爾”臍橙皮 (SOP) 富含類黃酮，使其在營養(yǎng)、食品和醫(yī)藥領域越來越受歡迎。然而，對于SOP中的黃酮類成分以及鎂脅迫下黃酮類生物合成的分子機制仍知之甚少。

研究材料

選擇中國涼山州雷波縣13年樹齡的“紐荷爾”臍橙 6月的幼果期(開花后90天，90DAF)、8月的快速膨大期(開花后150天，150DAF)和11月的果實成熟期(開花后240天，240DAF)樣品。MS樣品采自無缺鎂癥狀的枝條，MD樣品采自缺鎂導致葉片發(fā)黃的枝條。每組三個生物學重復。

研究思路

研究結果

在三個階段收集MS和MD的果實和葉子進行分析。MD葉的葉肉變黃，葉脈保持綠色，呈倒V形。相比之下，MS 葉子在整個采樣期間保持綠色。MD葉片出現(xiàn)缺鎂現(xiàn)象，分析表明MD葉片的鎂含量為264.16 mg/kg，低于最佳鎂含量。相比之下，MS葉片中的鎂含量為914.28 mg/kg，高于適當?shù)逆V含量范圍。接著作者分析了總黃酮含量、MDA 含量和SOD活性。結果表明，MS中總黃酮含量在幼果期由1303.16 μg/g上升至膨大期的1670.58 μg/g，在果實成熟期下降至1220.46 μg/g。在MD中，類黃酮含量從2000.38μg/g增加到2285.73μg/g，然后減少到1826.01μg/g。MD 中的總黃酮含量始終高于MS中的總黃酮含量。MS和MD的MDA含量和SOD活性與總黃酮含量趨勢一致。從MS和MD果皮樣品中總共檢測到 1,533 種代謝物，其中黃酮740 種（48.27%）。PCA、OPLS-DA、相關分析和HCA的結果反映了類黃酮譜差異與發(fā)育階段和鎂脅迫有關。

鎂脅迫下 MS 和 MD 果皮中類黃酮代謝物的分析。(A)混合樣品質(zhì)譜分析總離子色譜圖；(B)基于類黃酮豐度的18個樣品的PCA圖；(C)樣本相關性分析；(D)類黃酮代謝物熱圖

根據(jù)C3-C6-C3結構的修飾，將740種黃酮類化合物分為8類：黃酮類402種、黃酮醇類80種、黃烷酮類65種、查爾酮類31種、異黃酮類30種、黃烷醇類9種、黃酮醇類9種、其他黃酮類14種。Kmeans 分析顯示所有黃酮類化合物可分為六類。六個簇中的兩個（第2類和第3類）的變化趨勢與總黃酮含量一致。此外，不同發(fā)育階段的MS和MD之間的黃酮類化合物存在顯著差異。簇2和簇3的黃酮比例最高（98），表明這些簇可能在SOP中鎂脅迫下的類黃酮生物合成中發(fā)揮關鍵作用，黃酮受到顯著影響。根據(jù)FC≥ 2 or ≤ 0.5 和VIP ≥1進行差異代謝物篩選。其中，在MS1與MD1中鑒定出57個DAF，其次是MS2 vs MD2 (25) 和 MS3 vs MD3 (97)。MD中的DAF數(shù)量多于MS，表明黃酮類化合物可能更容易受到鎂脅迫的影響。KEGG通路富集分析表明，類黃酮生物合成、苯丙素生物合成、黃酮及黃酮醇生物合成、次生代謝物生物合成和代謝途徑是主要富集途徑。

鎂脅迫下MS和MD果皮中類黃酮代謝物的差異分析。(A) SOP 中檢測到的 740 種黃酮類化合物的分類和比例；(B) SOP 中差異代謝的趨勢分析；(C) DAF 的維恩圖；(D) MS2 vs MD2、MS1 vs MS3、MD1 vs MD3中DEG的KEGG 富集分析

轉錄組結果顯示，三個階段共檢測到17,897個差異表達基因（DEG）。熱圖聚類分析顯示不同處理之間基因表達存在顯著差異。GO，KEGG注釋分析了DEGs功能。其中KEGG主要富集包括代謝途徑（ko01100）、次生代謝物生物合成（ko01110）、MAPK信號通路-植物（ko04016）、植物激素信號轉導（ko04075）、苯丙素生物合成（ko00940）和鎂脅迫下的類黃酮生物合成（ko00941）等途徑。為了構建共表達網(wǎng)絡，WGCNA分析在MS和MD中識別出九個模塊。在三個發(fā)育階段，MS 和 MD 模塊之間的基因表達模式有所不同。利用21個DAF作為性狀，與模塊進行相關性分析。yellow模塊被發(fā)現(xiàn)與15種黃酮類化合物相關，并且與7種黃酮類化合物的相關性最高。bule模塊與柚皮素、短葉松黃烷酮（、異杞柳苷、柚皮素查爾酮的含量呈正相關。yellow模塊中大多數(shù)基因的表達水平在鎂脅迫下增加，且MD的表達水平高于MS。這與總黃酮含量的變化趨勢一致。對yellow模塊的GO分析表明，其DEG在生物過程類別中的代謝過程和細胞過程以及分子功能類別中的結合和催化活性顯著富集。KEGG富集分析顯示，yellow模塊基因中的苯丙素生物合成、異黃酮生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成等方面富集了40多個DEG。

MS 和 MD 中DEG 和 DAM 的綜合分析。(A)軟閾值的確定；(B)進行共表達模塊計算的基因網(wǎng)絡熱圖；(C)模塊熱圖；(D)模塊-性狀關系熱圖

基于與yellow模塊中黃酮含量的強正相關性構建基因共表達網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖識別出3個結構基因（1個CitLAR (Cs_ont_7g019870)、1個CitU88B1 (Cs_ont_9g026820)、1個參與類黃酮生物合成途徑的 CitSNL6 (Cs_ont_2g029030)）。在相互作用網(wǎng)絡圖中，10個轉錄因子與6種黃酮類化合物具有很強的相關性。這些TF基因中，有2個C2C2-Dofs、2個NACs、1個PLATZ、1個MYB、1個C2H2、1個FAR1、 1 個RWP-RK和 1 個DBP。同樣，blue模塊包含參與類黃酮合成的三個結構基因（2 CitF3 ' H (Cs_ont_2g033020、Cs_ont_9g024120)、1 CitCHS (Cs_ont_3g009610)）。該網(wǎng)絡確定了6個結構基因和10個TF基因作為SOP中類黃酮積累的關鍵調(diào)節(jié)因子。為驗證類黃酮相關基因的表達模式，對WGCNA共表達網(wǎng)絡中的6個中心結構基因和10個中心TF基因進行了qRT-PCR。結果證實了轉錄組數(shù)據(jù)的準確性和可重復性。

黃酮合成結構基因，IF與黃酮代謝物的相關性網(wǎng)絡圖

為了研究不同發(fā)育階段SOP中類黃酮生物合成的變化，對轉錄組和代謝組學數(shù)據(jù)進行了綜合分析。根據(jù)模式植物報道的黃酮類生物合成途徑，構建了SOP中結構基因和黃酮類化合物表達的通路圖。共有41個結構基因和21個黃酮類化合物被定位到黃酮類生物合成途徑。

鎂脅迫下 MS 和 MD中的類黃酮生物合成通路熱圖

相關性分析顯示，表沒食子兒茶素和橙皮素7-O-葡萄糖苷與CitCHI（Cs_ont_7g003040）和1種CitCHS（Cs_ont_9g012610）顯著正相關。CCA分析篩選SOP中黃酮類化合物生物合成的關鍵基因。結果表明，Cit PAL、Cit C4H、Cit 4CL、Cit FNS、Cit FLS、Cit F3'H 和Cit等 10 個基因在 SOPs 類黃酮生物合成中發(fā)揮重要作用?；蚋鶕?jù)其空間分布分為兩組。第一組包括Cit PAL (Cs_ont_7g006400)、Cit 4CL (Cs_ont_2g023650、Cs_ont_5g016610)、Cit FNS (Cs_ont_5g024870)、Cit ANS (Cs_ont_6g014730) 和Cit F3'H (Cs_ont_9g02) 4140)，第二組包括Cit C4H (Cs_ont_4g024900、Cs_ont_1g016250 )、Cit CHS (Cs_ont_9g012610) 和Cit FLS (Cs_ont_1g002760)。這些結果也表明了鎂脅迫對果實生長發(fā)育不同階段的黃酮類化合物存在影響。

SOP中類黃酮生物合成主要貢獻基因的篩選。(A) 21 個類黃酮和 41 個類黃酮合成相關基因的組間相關性分析；(B) SOP 中 MS 和 MD 之間 21 種類黃酮和相關合成基因的典型相關性(CCA)分析

鎂脅迫下 SOP 中類黃酮生物合成的模型圖

該項目由四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院青年教師熊博、碩士研究生李琴為論文共同第一作者，四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院汪志輝教授、熊博博士為論文通訊作者。該研究受到國家重點研發(fā)計劃項目、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點實驗室開放課題及四川省科技計劃項目的資助。

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