1、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因修復(fù)的基本原理

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因修復(fù)的基本操作和做基因敲除（Knock out）基本一致，除此之外，它引入了一條修復(fù)模板（repair template），通常為單鏈寡核苷酸序列（ssODNs）[1]。sgRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)將Cas9核酸酶引導(dǎo)到特定的基因組序列，Cas9核酸酶在PAM位點(diǎn)上游三個(gè)堿基處引入DNA雙鏈斷裂，這時(shí)真核細(xì)胞會(huì)通過兩種不同的機(jī)制進(jìn)行DNA修復(fù)。一種是非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ），另一種是同源重組（homology-directed repair, HDR）。非同源末端連接通過在DNA雙鏈斷裂處增加或刪除幾個(gè)堿基，在DNA連接酶的作用下，實(shí)現(xiàn)DNA修復(fù)，但這種機(jī)制通常會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)堿基的隨機(jī)插入或缺失（indels），可能造成移碼突變，進(jìn)而導(dǎo)致基因失活。同源重組即真核細(xì)胞可以利用外源的DNA片段，精準(zhǔn)復(fù)制外源的DNA片段中蘊(yùn)含的遺傳信息，以實(shí)現(xiàn)敲入（knock in）、點(diǎn)突變、插入缺失突變等，也可以用來實(shí)現(xiàn)基因修復(fù)，如圖1所示[2]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因修復(fù)正是利用了同源重組的機(jī)制。

?圖1 ?CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

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2、在設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)流程需注意的事項(xiàng)

需要注意的是，同源重組（HDR）發(fā)生的概率通常較非同源末端連接（NHEJ）要低[3]。此外，PAM 位點(diǎn)的選擇、供體 DNA 的類型、供體 DNA 的濃度等因素也會(huì)對(duì)同源重組的效率產(chǎn)生影響[4]。

A、一般情況下，為了提高同源重組的效率，Cas9核酸酶的切割位點(diǎn)應(yīng)盡可能靠近突變引入的位置。但是，并非所有插入位點(diǎn)附近都有合適的PAM位點(diǎn)，此時(shí)只能選擇切割效率最高的PAM位點(diǎn)，同時(shí)距離插入位點(diǎn)越近越好，以盡可能地提高同源重組的效率。

B、在進(jìn)行基因修復(fù)時(shí)，可以將插入位點(diǎn)放置在單鏈寡核苷酸（ssODNs）供體模板的中間位置。在具有較短同源臂的情況下，單鏈寡核苷酸（ssODNs）由于其自身的特點(diǎn)，能夠產(chǎn)生比雙鏈DNA（dsDNA）更高的同源重組效率。ssODNs模板中同源臂長度通常在50~100個(gè)堿基，這被普遍認(rèn)為足以有效促進(jìn)同源重組的發(fā)生。實(shí)際上，增加任意一端的同源臂長度可能會(huì)對(duì)ssODNs的合成和遞送過程帶來一定的困難。

C、在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因修復(fù)中，如果在donor模板中保留了原來的PAM序列，則存在再次被CRISPR/Cas9識(shí)別和切割的風(fēng)險(xiǎn)。為了避免這種情況發(fā)生，通常會(huì)引入同義突變而改變PAM位點(diǎn)的序列，使其無法被CRISPR/Cas9再次識(shí)別。

?圖2 ?CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組敲入（Knock in）的機(jī)制

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3、應(yīng)用實(shí)例

通過CRISPR/Cas9對(duì)患者衍生的iPSC系進(jìn)行了基因修復(fù)，以治療囊性纖維化、血友病A和β-地中海貧血等遺傳疾病[5-7]。最近的研究，已經(jīng)能夠在小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了基因矯正，比如治療遺傳性耳聾（通過脂質(zhì)復(fù)合物遞送）、血友病B（通過AAV遞送）和α1-抗胰蛋白酶缺乏癥（通過AAV遞送）等疾病[8-10]。

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?參考文獻(xiàn) ：

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