摘要

冷凍電鏡（cryo-EM）被廣泛用于解析與G蛋白或抑制蛋白復(fù)合的活化G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的結(jié)構(gòu)。

然而，將其應(yīng)用于沒(méi)有信號(hào)蛋白的GPCR仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)受體在其可溶性結(jié)構(gòu)域中缺乏結(jié)構(gòu)特征以促進(jìn)圖像對(duì)準(zhǔn)。在GPCR晶體學(xué)中，于跨膜螺旋5和6之間插入一個(gè)融合蛋白是一個(gè)非常成功的結(jié)晶策略。盡管類(lèi)似的策略有可能廣泛地促進(jìn)不含信號(hào)蛋白的GPCRs的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，但使這種方法成功的關(guān)鍵決定因素還不清楚。

在這里，我們通過(guò)探索不同的融合蛋白設(shè)計(jì)來(lái)解決這一缺陷，這導(dǎo)致了拮抗劑結(jié)合的A2A腺苷受體在3.4?的分辨率和在3.7?的分辨率下未配位的Smoothened結(jié)構(gòu)。這里探討的融合策略可能適用于其他GPCR和小型整體膜蛋白的冷凍電鏡解析。

| Introduction 簡(jiǎn)介 |

PCR是最大的整體膜蛋白家族。所有的GPCR都有一個(gè)共同的七跨膜螺旋（7TM）結(jié)構(gòu)，并被分為六個(gè)家族，從A到F1。激動(dòng)劑結(jié)合后，GPCR通過(guò)與異源三聚體G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRKs）和抑制蛋白2相互作用，激活各種下游信號(hào)通路。

作為一個(gè)家族，GPCR代表了許多人類(lèi)疾病的一類(lèi)重要的藥物靶點(diǎn)3。在過(guò)去的十年中，方法學(xué)的進(jìn)步為GPCR功能的結(jié)構(gòu)和機(jī)制提供了深刻的見(jiàn)解。繼續(xù)對(duì)所有功能狀態(tài)下的GPCR進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，包括未配體的apo、被拮抗劑滅活的apo、被激動(dòng)劑激活的apo以及與下游信號(hào)蛋白復(fù)合物中的GPCRs的持續(xù)結(jié)構(gòu)分析，對(duì)于理解GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及促進(jìn)治療發(fā)展仍然至關(guān)重要。

X射線晶體學(xué)最初提供了一種強(qiáng)大的方法來(lái)確定許多GPCR結(jié)構(gòu)。雖然像GPCRs這樣的完整膜蛋白很難結(jié)晶，但一個(gè)非常成功的策略是設(shè)計(jì)一種融合蛋白來(lái)取代位于跨膜螺旋5 (TM5)和6 (TM6)之間的第三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)(ICL3)，以便插入的融合蛋白可以介導(dǎo)晶體接觸4,5。這種方法與脂質(zhì)立方相晶體學(xué)相結(jié)合，已經(jīng)在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了400多個(gè)沉積結(jié)構(gòu)。

雖然X射線晶體學(xué)在獲得與高親和力拮抗劑或激動(dòng)劑結(jié)合的GPCRs的結(jié)構(gòu)方面非常成功，但獲得未配位的受體或GPCR-信號(hào)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)仍然具有挑戰(zhàn)性，這可能是由于未配位或活性狀態(tài)的受體的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)抑制了晶體形成。

冷凍電鏡（cryo-EM）已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)測(cè)定的一種革命性的方法。

冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)測(cè)定并不依賴于蛋白質(zhì)的結(jié)晶，而是依靠計(jì)算排列和平均單個(gè)分子的圖像來(lái)產(chǎn)生三維(3D)重建6,7。然而，冷凍電鏡的一個(gè)核心挑戰(zhàn)是，三維重建的分辨率取決于單個(gè)分子圖像的相互對(duì)齊的準(zhǔn)確性。大多數(shù)GPCRs的平均分子量小于40kDa，其關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)特征嵌入在膜內(nèi)；在純化的系統(tǒng)中，這些區(qū)域往往存在于洗滌劑膠束或脂質(zhì)納米盤(pán)內(nèi)。對(duì)于這種突出于7TM域沒(méi)有明顯可區(qū)分結(jié)構(gòu)特征的小膜蛋白，顆粒對(duì)準(zhǔn)是非常具有挑戰(zhàn)性的。

盡管如此，冷凍電鏡已經(jīng)徹底改變了GPCR信號(hào)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定。這一成功的一個(gè)關(guān)鍵原因是，剛性連接的信號(hào)蛋白驅(qū)動(dòng)粒子在膜內(nèi)7TM區(qū)域的排列（補(bǔ)充圖1a）。更廣泛地說(shuō)，對(duì)于膜外沒(méi)有明顯結(jié)構(gòu)特征的小膜蛋白靶標(biāo)，如果剛性結(jié)合，添加抗體片段(Fab)等基準(zhǔn)標(biāo)記可以促進(jìn)精確的圖像對(duì)齊8。

補(bǔ)充圖. 1?| 通過(guò)單顆粒冷凍電鏡確定GPCRs結(jié)構(gòu)的策略

「A.?降鈣素受體(CTR)-Gs復(fù)合物是通過(guò)單顆粒冷凍電鏡確定的GPCR/G蛋白復(fù)合物的一個(gè)例子

B.?谷氨酸受體的結(jié)構(gòu)是通過(guò)單顆粒冷凍電鏡確定的GPCR二聚體的一個(gè)例子

C.?hFzd5-Bril與anti-BRIL Fab和anti-Fab nanobody13復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

D-F.?融合蛋白BRIL和PGS插入A2AR-BRIL24（d）、SMO19（e）和OX129（f）中的例子。這些構(gòu)建體有利于通過(guò)X射線晶體學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。在這些例子中，BRIL以兩個(gè)延伸螺旋插入A2AR（d），以一個(gè)延伸螺旋插入SMO（e）。PGS被插入一個(gè)擴(kuò)展螺旋（f）」

在理想的情況下，冷凍電鏡方法還可以在沒(méi)有信號(hào)蛋白的情況下對(duì)GPCRs進(jìn)行常規(guī)結(jié)構(gòu)測(cè)定。這將有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)拮抗劑結(jié)合的受體或特別是未配體的受體的分析，而且還沒(méi)有結(jié)晶的固有挑戰(zhàn)。雖然現(xiàn)在有一些未配體的B族和C族GPCRs的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，這些受體在體外形成穩(wěn)定的二聚體和/或有相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（補(bǔ)充圖1b）9-11。

補(bǔ)充圖. 2 | A2AR-BRIL的單顆粒分析

「A.?A2AR-BRIL樣品的代表性原始圖像

B.?A2AR-BRIL樣品的二維平均值

C.?純化的A2AR-BRIL（灰色）和A2AR-BRIL/Fab復(fù)合物（藍(lán)色）的SEC曲線

D.?按局部分辨率著色的密度圖

E&F.?完整復(fù)合物和TM區(qū)域的定向傅里葉殼相關(guān)（dFSC）曲線

G.?A2ARBRIL/Fab復(fù)合物的代表性原始圖像。」

最近，納米抗體已被證明可以通過(guò)識(shí)別嫁接的細(xì)胞內(nèi)環(huán)路來(lái)實(shí)現(xiàn)非活性狀態(tài)下的GPCRs的高分辨率重建12。原則上，將融合蛋白剛性地附著在沒(méi)有大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的較小GPCR上，可能足以驅(qū)動(dòng)粒子在膜區(qū)的排列，產(chǎn)生7TM結(jié)構(gòu)域的高分辨率重建。

事實(shí)上，最近在F族人類(lèi)Frizzled5（hFzd5）受體上的成功表明，ICL3融合apocytochrome b562融合蛋白BRIL，結(jié)合抗BRIL Fab片段和抗Fab納米抗體，可以產(chǎn)生受體7TM結(jié)構(gòu)域的可解釋性重建（補(bǔ)充圖1c）13。然而，一個(gè)基本的限制是，這種成功的重建所需的設(shè)計(jì)原則仍不清楚。

我們?cè)谶@項(xiàng)研究中的目標(biāo)是了解哪些因素能使使用融合蛋白策略的單個(gè)GPCR的三維重建取得成功。我們旨在解決兩個(gè)重要的設(shè)計(jì)考慮：

（1）成功的粒子對(duì)準(zhǔn)是否需要有一個(gè)特定的融合蛋白尺寸？

（2）融合蛋白通過(guò)螺旋延伸的剛性附著對(duì)粒子的排列是必需的嗎？

我們使用兩個(gè)模型系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行這種分析，即腺苷A2A受體（A2AR）和Smoothened受體（SMO）14-22，這兩個(gè)受體以前都是通過(guò)X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡來(lái)分析的。通過(guò)探索各種融合策略，我們確定了洗滌劑膠束中拮抗劑結(jié)合的無(wú)活性A2AR的3.4?分辨率結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)環(huán)境中未配位的無(wú)活性SMO的3.7?結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)例子為融合蛋白的使用提供了設(shè)計(jì)指南，使得冷凍電鏡可能適用于其他GPCRs和其他小的整合膜蛋白。

| Results 成果?|

—「與Fab結(jié)合的剛性連接的融合蛋白使A2AR結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)」

我們首先探討了GPCR融合蛋白的策略是否可以實(shí)現(xiàn)7TM區(qū)域的高分辨率結(jié)構(gòu)測(cè)定。受最近hFzd5的3.7?分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的鼓舞（補(bǔ)充圖1c）13,23，我們?cè)噲D確定融合蛋白策略的"最低要求"。因此，我們使用了以前產(chǎn)生了1.8?晶體結(jié)構(gòu)的A2AR構(gòu)建體（補(bǔ)充圖1d）24。

這個(gè)構(gòu)建體的幾個(gè)特點(diǎn)是值得注意的。首先，該結(jié)構(gòu)是用高親和力拮抗劑ZM241385確定的。其次，該構(gòu)建體含有熱穩(wěn)定突變，可能進(jìn)一步限制了構(gòu)象的異質(zhì)性。最后，該構(gòu)建體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，BRIL結(jié)構(gòu)域通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的螺旋將受體的TM5和TM6分別連接到BRIL的N端和C端，與受體7TM結(jié)構(gòu)域緊密相連。

這些特點(diǎn)使其成為測(cè)試融合蛋白驅(qū)動(dòng)圖像對(duì)準(zhǔn)要求的理想例子。因此，我們?cè)谂cZM241385結(jié)合的L-MNG/CHS中純化了A2AR-BRIL融合構(gòu)建體，進(jìn)行冷凍電鏡研究（補(bǔ)充圖2）24。

我們最初試圖確定ZM241385與A2AR-BRIL結(jié)合的結(jié)構(gòu)，依靠緊密連接的BRIL結(jié)構(gòu)域（MW ~10 kD）作為唯一的參照物。盡管進(jìn)行了大量的數(shù)據(jù)收集和圖像處理，我們既無(wú)法確定具有足夠清晰結(jié)構(gòu)特征的二維類(lèi)平均數(shù)（補(bǔ)充圖2a，b），也無(wú)法生成合理的三維重建，即使我們使用低通濾波的晶體結(jié)構(gòu)作為初始參考模型。

這些結(jié)果表明，單獨(dú)的BRIL結(jié)構(gòu)域，即使牢固地附著在蛋白質(zhì)上，也不能提供足夠的特征來(lái)實(shí)現(xiàn)GPCR的顆粒排列。按照hFzd5的成功策略，我們接下來(lái)添加了一個(gè)抗BRIL的Fab片段來(lái)擴(kuò)大靶標(biāo)。

顯然，更大的靶標(biāo)成功地推動(dòng)了粒子對(duì)準(zhǔn)，并產(chǎn)生了一個(gè)全局分辨率約為3.4?的重建。進(jìn)一步集中細(xì)化，將跨膜域的分辨率提高到3.2?，足以使模型建立（圖1，補(bǔ)充圖2和3）。

圖. 1?| A2AR-BRIL的單顆粒冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

「A-C.?與抗BRIL Fab結(jié)合的A2AR-BRIL的冷凍電鏡密度圖的三個(gè)不同視圖

D&E.?結(jié)合口袋中化合物ZM241385的特寫(xiě)視圖

F.?磷脂酰絲氨酸的對(duì)接所強(qiáng)調(diào)的脂質(zhì)密度位置」

補(bǔ)充圖. 3 |?A2AR-BRIL/Fab的冷凍電鏡數(shù)據(jù)分析流程圖

「流程圖說(shuō)明了確定A2ARBRIL/Fab復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)處理過(guò)程」

A2AR-BRIL/Fab的冷凍電鏡重建與A2AR-BRIL的X射線晶體結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，整體均方根偏差（RMSD）為0.9?。配體ZM241385在配體結(jié)合袋中被很好地解析（圖1d，e），表明該策略可以使藥物結(jié)合可視化。

此外，我們?cè)贏2AR附近的膜內(nèi)葉上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有兩個(gè)脂肪族尾巴的脂質(zhì)密度，以及TM5和TM6之間的一個(gè)極性頭團(tuán)，這在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中以前的58個(gè)A2AR的X射線和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中都沒(méi)有觀察到。我們推測(cè)它是磷脂酰絲氨酸，因?yàn)樗c密度最匹配（圖1f），并且與鑒定磷脂酰絲氨酸為A2AR25共純化脂質(zhì)的天然質(zhì)譜研究一致。

基于這些結(jié)果，我們得出結(jié)論，Fab與剛性附著的BRIL緊密結(jié)合是必要的，以作為單顆粒圖像對(duì)準(zhǔn)的基準(zhǔn)標(biāo)記。

—「單個(gè)螺旋BRIL連接不足以進(jìn)行高分辨率重建」

我們接下來(lái)旨在了解是什么因素驅(qū)動(dòng)了融合蛋白與GPCR的緊密連接。對(duì)于A2AR和hFzd5，BRIL是以兩個(gè)延伸的螺旋連接到7TM結(jié)構(gòu)域的。

然而，這種安排要求TM5和TM6的方向與BRIL的N端和C端螺旋精確匹配；事實(shí)上，hFzd5的結(jié)構(gòu)需要在這個(gè)交界處進(jìn)行重大的工程設(shè)計(jì)才能成功13。更常見(jiàn)的是，BRIL結(jié)構(gòu)域僅通過(guò)一個(gè)延伸的螺旋插入到GPCR或其他靶蛋白中19，因?yàn)?strong>剛性連接不是結(jié)晶的必要條件。

因此，我們問(wèn)道，當(dāng)另一個(gè)不一定嫁接有剛性或短連接體時(shí)，連接到目標(biāo)蛋白上的融合蛋白只在一個(gè)連接體部位有一個(gè)延伸的螺旋，是否能促進(jìn)高分辨率的結(jié)構(gòu)測(cè)定。

對(duì)于這種方法，我們使用了小鼠SMO（mSMO），它是另一種GPCR，先前已經(jīng)確定了晶體和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。野生型mSMO包含一個(gè)7TM結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞外富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）17,18。以前對(duì)SMO與Gi結(jié)合的冷凍電鏡研究無(wú)法解決CRD區(qū)域，這表明它是靈活的，不太可能驅(qū)動(dòng)圖像排列。然而，像A2AR一樣，在SMO ICL3中插入一個(gè)BRIL結(jié)構(gòu)域促進(jìn)了SMO的結(jié)晶14,19（補(bǔ)充圖1e）。

值得注意的是，與A2AR晶體結(jié)構(gòu)不同，該構(gòu)建體在SMO的TM5和BRIL的N端之間只有一個(gè)延伸螺旋。因此，我們使用這種融合策略來(lái)測(cè)試BRIL與單一擴(kuò)展螺旋的連接，無(wú)論是否有抗BRIL Fab，是否足以驅(qū)動(dòng)圖像對(duì)準(zhǔn)。

早期的研究將脂質(zhì)納米盤(pán)作為一個(gè)受控的膜環(huán)境來(lái)檢測(cè)膽固醇對(duì)SMO活性的要求26。因此，我們將純化的mSMO-BRIL重組到由saposin（Salipro）27形成的脂質(zhì)納米顆粒中，并加入膽固醇。作為一種膜支架蛋白，saposin允許形成與重組膜蛋白大小相適應(yīng)的脂質(zhì)納米顆粒，提供了脂質(zhì)環(huán)境的好處，但沒(méi)有給納米顆粒增加過(guò)多的非結(jié)構(gòu)化密度。

一致的是，與沒(méi)有抗BRIL Fab的A2AR-BRIL的情況一樣，我們無(wú)法單獨(dú)確定mSMO-BRIL的高分辨率結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充圖5a，d）。然而，與A2AR-BRIL/Fab的情況不同，加入抗BRIL Fab以擴(kuò)大基準(zhǔn)標(biāo)記并沒(méi)有產(chǎn)生任何改善（補(bǔ)充圖5e）。這不太可能是由mSMO重組到saposin納米顆粒造成的。

補(bǔ)充圖. 5 |?評(píng)估SMO-PGS/BRIL的制備

「A.?純化的mSMO-BRIL和mSMO-PGS2在洗滌劑或salipro中通過(guò)凝膠過(guò)濾的篩選結(jié)果

B.?在制備低溫載網(wǎng)之前，mSMO-PGS2在salipro中的凝膠過(guò)濾結(jié)果

C.?經(jīng)庫(kù)馬西藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠圖像

D&E.?沒(méi)有（d）或有（e）抗BRIL的mSMO-BRIL通過(guò)低溫EM的二維平均值

F&G.?電鏡負(fù)染下，mSMO-PGS2的一張代表性原始顯微照片（f）和二維平均數(shù)（g）。」

我們推測(cè)，要么單獨(dú)的BRIL不夠大，不能驅(qū)動(dòng)圖像對(duì)準(zhǔn)（如上面A2AR-BRIL的情況所示），要么單獨(dú)的BRIL與單一的延伸螺旋的連接可能不夠緊密，而靈活性會(huì)因加入抗BRIL Fab而放大。這些結(jié)果表明，一個(gè)具有兩個(gè)延伸螺旋的BRIL與一個(gè)抗BRIL Fab結(jié)合的構(gòu)建體對(duì)于在冷凍電鏡重建中獲得足夠的分辨率可能很重要。

—「通過(guò)PGS融合實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)納米盤(pán)中apo SMO的結(jié)構(gòu)」

我們轉(zhuǎn)向另一種融合蛋白的方法，以實(shí)現(xiàn)無(wú)活性apo mSMO的結(jié)構(gòu)測(cè)定。

考慮到精確插入具有兩個(gè)延伸螺旋的融合蛋白的挑戰(zhàn)，我們認(rèn)為通過(guò)一個(gè)單一的剛性螺旋連接一個(gè)更大的融合蛋白可能更容易設(shè)計(jì)。我們選擇了來(lái)自Pyrococcus abyssi（PGS）的熱穩(wěn)定糖原合成酶結(jié)構(gòu)域（MW ~20 kD），這是一種融合蛋白，已被用于確定GPCR晶體結(jié)構(gòu)，包括CB1大麻素受體28，以及OX1和OX2奧曲肽受體29（補(bǔ)充圖1f）。

我們預(yù)計(jì)，假設(shè)有一個(gè)剛性的連接，單獨(dú)的PGS，比BRIL體積大，但比BRIL/anti-BRIL fab小，可能足以作為一個(gè)具有單一延伸螺旋的基準(zhǔn)標(biāo)記。

我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)不同的構(gòu)建體，mSMO-PGS1，其中PGS結(jié)構(gòu)域在ICL3的441位之后和TM6的445位之前插入到SMO，以及mSMO-PGS2，其中PGS在TM6中向上插入了一個(gè)半螺旋圈（五個(gè)氨基酸）（補(bǔ)充圖4）。

補(bǔ)充圖. 4 |?SMO-PGS的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

「A.?為SMO-PGS設(shè)計(jì)的兩個(gè)構(gòu)建體的詳細(xì)圖示

B.?本研究和其他出版物中關(guān)于ICL3修飾的序列排列。本研究中的mSMO-BRIL構(gòu)建體與結(jié)晶中使用的BRIL插入ICL3相同（PDB ID: 4QIN）」

AlphaFold30預(yù)測(cè)PGS的C端螺旋在兩個(gè)構(gòu)建體中都作為一個(gè)連續(xù)的螺旋延伸到mSMO的TM6，但在mSMO-PGS1中PGS取向于7TM束的一側(cè)，在mSMO-PGS2中直接位于7TM束的下方（圖2a中藍(lán)色和黃色條帶）。

圖. 2 | AlphaFold2（AF2）預(yù)測(cè)的mSMO-PGS1（藍(lán)色）和mSMO-PGS2（黃色）的原子模型。請(qǐng)注意，在這兩個(gè)構(gòu)建體中，插入的PGS被預(yù)測(cè)為在兩個(gè)相反的方向上定向。

「B.?根據(jù)mSMO-PGS1確定的冷凍電鏡密度，與AF2預(yù)測(cè)的原子模型對(duì)接（藍(lán)色條帶）。

C.?由mSMO-PGS2確定的低溫電鏡密度，與AF2預(yù)測(cè)的原子模型對(duì)接（黃色條帶）

D.?確定的結(jié)構(gòu)（粉紅色條帶）和預(yù)測(cè)的mSMO-PGS2的原子模型的重疊。

E-G.?在mSMO-PGS1的預(yù)測(cè)模型（e）、mSMO-PGS2的預(yù)測(cè)模型（f）和mSMO-PGS2的確定結(jié)構(gòu)（g）中，SMO TM6和PGS之間連接區(qū)域的放大圖。」

在這兩種情況下，PGS的N端通過(guò)一個(gè)環(huán)與TM5的C端相連。同上，我們將純化的mSMO-PGS重組到添加了膽固醇的脂質(zhì)saposin nanoparticle27。我們得到了重組在納米粒子中的表現(xiàn)良好的mSMO-PGS蛋白，并使用尺寸排除色譜法的峰值部分制備了冷凍電鏡載網(wǎng)（補(bǔ)充圖5b-c，和f-g）。

我們成功地從兩個(gè)mSMO-PGS構(gòu)建體中確定了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。盡管這些構(gòu)建體的差異很小，但這些結(jié)構(gòu)的分辨率差異很大（圖2，補(bǔ)充圖6-8）。

補(bǔ)充圖. 6?|?構(gòu)建體mSMO-PGS1的數(shù)據(jù)處理的工作流程

「流程圖說(shuō)明了確定mSMOPGS1冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)處理過(guò)程。」

我們只從mSMO-PGS1中獲得了~6 ?的分辨率（圖2b和補(bǔ)充圖6），這表明融合蛋白的整體結(jié)構(gòu)與AlphaFold預(yù)測(cè)一致。雖然不足以建立新的模型，但該分辨率足以使TM束的位置得到確定。TM6和PGS的方向表明，mSMO和PGS之間的連接保持了一個(gè)延伸的螺旋，與AlphaFold的預(yù)測(cè)相匹配。這種類(lèi)型的連接與PGS連接CB1大麻素受體28、OX1和OX2奧曲肽受體的方式相似29，這些受體的晶體結(jié)構(gòu)顯示了這種連接。

我們的結(jié)論是，與mSMO-BRIL構(gòu)建體的情況相似，單螺旋延伸到PGS的融合不足以進(jìn)行高分辨率的重建。

圖. 3 | SMO/MC4R/MT1和PGS融合蛋白之間的疏水界面

「A&B.?mSMO-PGS2結(jié)構(gòu)的兩個(gè)不同視圖顯示了受體和PGS的相對(duì)方向

C.?mSMO和PGS之間促進(jìn)PGS剛性附著的疏水相互作用的放大圖，包括PGS（左邊的球體）和SMO中的關(guān)鍵殘基

D&E.?MC4R結(jié)構(gòu)的兩個(gè)不同視圖（PDB ID: 6W25 ref. 31）

F.?框內(nèi)區(qū)域的放大圖顯示了在mSMO-PGS2中觀察到的相同PGS殘基與MC4R中非極性殘基的相互作用。i 框內(nèi)區(qū)域的放大圖顯示了在mSMO-PGS2中觀察到的與MT1中非極性殘基相同的PGS殘基的相互作用。

G&H.?MT1結(jié)構(gòu)的兩個(gè)不同視圖（PDB ID: 6ME2 ref. 32）。MT1與PGS的接觸區(qū)域用海藍(lán)色的表面表示。

I.?框內(nèi)區(qū)域的放大圖顯示了在mSMO-PGS2中觀察到的與MT1中非極性殘基相同的PGS殘基的相互作用」

令人驚訝的是，mSMO-PGS2的重建與AlphaFold的預(yù)測(cè)不同，但達(dá)到了3.7 ?的明顯更好的分辨率（圖2c，補(bǔ)充圖7和8）。與AlphaFold預(yù)測(cè)不同的是，PGS位于TM束下面的方向，在mSMO的TM6和PGS的C端之間沒(méi)有一個(gè)連續(xù)的螺旋，而是一個(gè)扭曲的環(huán)，使PGS結(jié)構(gòu)域直接與mSMO 7TM束相互作用。在mSMO和PGS的界面上，PGS的一個(gè)疏水環(huán)（F1124、L1126、L1129、I1149和F1195）與TM3和TM5底部的疏水殘基（F347、L350、I433和L440）接觸（圖3a-c）。

補(bǔ)充圖. 7 |?構(gòu)建體mSMO-PGS2的數(shù)據(jù)處理的工作流程

「流程圖說(shuō)明了確定mSMOPGS2冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)處理過(guò)程。」

補(bǔ)充圖. 8?|?高分辨率下mSMO-PGS2的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

「A.?方向性傅里葉殼相關(guān)（dFSC）曲線

B.?重建中使用的最終粒子的歐拉角分布的直方圖表示

C.?使用局部分辨率（?）信息從最高分辨率（深藍(lán)色）到最低分辨率（紅色）著色的電鏡圖

D.?跨膜螺旋的密度和原子模型

E.?圖.4 d/e中的方框區(qū)域的放大圖，突出mSMO-PGS2在密度圖中的建模。三個(gè)殘基被標(biāo)記，包括Y398、R404和F488」

這種與mSMO細(xì)胞內(nèi)側(cè)的未預(yù)料到的疏水作用可能穩(wěn)定了PGS相對(duì)于mSMO的方向。我們推測(cè)，這種相互作用使得PGS能夠剛性地附著在mSMO上，并促進(jìn)了mSMO 7TM結(jié)構(gòu)域的高分辨率重建。如果PGS結(jié)構(gòu)域作為融合蛋白插入到TM5和TM6的兩個(gè)非剛性環(huán)連接，那么類(lèi)似的相互作用很可能發(fā)生在其他GPCR中。

事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)例子，其中融合的PGS促進(jìn)了MC4R（PDB代碼：6W2531）和MT1（PDB代碼：6ME232）的結(jié)晶。這兩個(gè)晶體結(jié)構(gòu)顯示了PGS結(jié)構(gòu)域和GPCRs之間類(lèi)似的疏水相互作用（圖3d-i），從這三個(gè)結(jié)構(gòu)計(jì)算出的PGS和GPCRs之間的埋藏面積為836 ?2（mSMO），350 ?2（MC4R），和533 ?2（MT1）。

在H1R和GLP-1R中也可以找到類(lèi)似的疏水殘基（補(bǔ)充圖9a，b）。值得注意的是，人類(lèi)SMO中相當(dāng)?shù)氖杷畾埢才cSMO-Gi復(fù)合物（PDB ID：6XBM）中Gi的α5螺旋中的疏水殘基相互作用（補(bǔ)充圖9c），表明PGS和Gi與SMO的相互作用是相似的，即使SMO在本研究中處于無(wú)配體的非活性狀態(tài)，但與Gi復(fù)合物中處于興奮劑結(jié)合的激活狀態(tài)。考慮到G蛋白中這些高度保守的疏水殘基（補(bǔ)充圖9d-f）被認(rèn)為與其他GPCRs的類(lèi)似疏水區(qū)域相互作用，我們預(yù)測(cè)PGS與其他GPCRs的TM3/TM5區(qū)域之間可能存在類(lèi)似的相互作用。

補(bǔ)充圖. 9 |?SMO-PGS和GPCR/G蛋白復(fù)合體中存在的疏水相互作用

「A.?SMO和PGS之間的疏水相互作用B.?SMO（本研究）與GLP-1R（PDB ID: 5VEW）和H1R（PDB ID: 3RZE）的結(jié)構(gòu)疊加。C.?人類(lèi)SMO/Gi蛋白復(fù)合物的疏水相互作用D.?GLP-1R/Gs蛋白復(fù)合物的疏水相互作用E.?H1R-Gq蛋白復(fù)合物的疏水相互作用F.?G蛋白家族中α5的序列排列。」

我們?cè)诖舜_定的兩個(gè)結(jié)構(gòu)，比較表明，PGS作為一個(gè)融合蛋白足以促進(jìn)高分辨率的結(jié)構(gòu)測(cè)定，但需要與SMO的穩(wěn)定連接。與此相關(guān)的是，與PGS的單一延伸螺旋連接而沒(méi)有額外的蛋白（蛋白相互作用）不足以產(chǎn)生所需的結(jié)構(gòu)剛性。

我們?cè)缙谑褂脝温菪膍SMO-BRIL融合的結(jié)構(gòu)上的不確定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。相反，在mSMO-PGS2中PGS和mSMO之間的疏水作用提供了足夠的穩(wěn)定，以實(shí)現(xiàn)高分辨率的結(jié)構(gòu)（圖3c和補(bǔ)充圖9a）。

—「脂質(zhì)環(huán)境中apo SMO的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)甾醇部位」

SMO是Hedgehog信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵成分，牽涉到胚胎發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)33。SMO功能障礙導(dǎo)致出生缺陷和癌癥34。SMO的活性由Hedgehog（Hh）的受體Patched調(diào)節(jié)。

目前一個(gè)關(guān)于Hedgehog信號(hào)的模型表明，Patched通過(guò)膜運(yùn)輸甾醇，并在膜內(nèi)頁(yè)保持較低的局部甾醇濃度；這使SMO失去活性35。在與Hedgehog結(jié)合時(shí)對(duì)Patched的抑制會(huì)增加內(nèi)頁(yè)的甾醇濃度并釋放SMO的抑制。在迄今發(fā)表的17個(gè)SMO結(jié)構(gòu)中，有12個(gè)受體單獨(dú)或與納米抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和5個(gè)受體與Gi蛋白復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，盡管Gi蛋白參與SMO信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍有爭(zhēng)議36。

我們?cè)趕aposin脂質(zhì)納米圓盤(pán)中的mSMO的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)使7TM和連接域（LD）的建模成為可能，它將細(xì)胞外CRD與7TM域連接起來(lái)（圖2c）。

SMO CRD的大部分在我們的圖中分辨率很低，除了在連接7TM和CRD的區(qū)域有兩個(gè)小的密度片段，其中一個(gè)有短螺旋的外觀。apo SMO中CRD的結(jié)構(gòu)靈活性類(lèi)似于以前與Gi結(jié)合的活性SMO的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，其中CRD是未解決的。相比之下，以前的SMO單獨(dú)的晶體結(jié)構(gòu)解決了CRD的問(wèn)題，這表明這個(gè)特定的方向可能是由晶體接觸穩(wěn)定的。

我們將SMO與CRD的三個(gè)可用的原子模型對(duì)接到我們的密度圖中，每個(gè)模型代表CRD相對(duì)于7TM束的不同方向。短螺旋狀的密度與對(duì)接的CRD結(jié)構(gòu)域中的任何螺旋都不匹配（補(bǔ)充圖10），表明我們的結(jié)構(gòu)中CRD的構(gòu)象可能與所有其他可用的結(jié)構(gòu)不同，或者說(shuō)，CRD在沒(méi)有配體或晶體包裝的情況下更靈活。

補(bǔ)充圖. 10 | 代表性原子模型與mSMO-PGS2密度圖的對(duì)接

「A&B. 從左到右，對(duì)接新建立的原子模型，SMO-膽固醇，SMO/Gi蛋白，和SMO-環(huán)胺模型。」

與以前的SMO結(jié)構(gòu)相比，我們的apo SMO結(jié)構(gòu)與非活性SMO相似，7TM區(qū)域的整體RMSD為0.75?，TM5和TM6的構(gòu)象與非活性受體一致（圖4a）。SMO在7TM結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個(gè)大的口袋，這是內(nèi)源性甾醇的結(jié)合點(diǎn)，對(duì)通路的激活和合成的小分子興奮劑、拮抗劑和異生調(diào)節(jié)劑很重要15,19。與apo狀態(tài)一致，在我們的結(jié)構(gòu)中，這個(gè)口袋是空的，沒(méi)有任何結(jié)合的配體或甾醇的明顯密度（圖4b）。事實(shí)上，apo SMO的配體結(jié)合口袋太窄，無(wú)法容納7TM束內(nèi)的甾醇，這在以前的一個(gè)活性SMO結(jié)構(gòu)（PDB ID：6O3C）15中觀察到（圖4b，c）。

圖. 4?|?apo狀態(tài)的mSMO的結(jié)構(gòu)

「A.?apo狀態(tài)下的mSMO（本研究）與拮抗劑結(jié)合的非活性狀態(tài)（PDB ID：5L7D）和激動(dòng)劑結(jié)合的活性狀態(tài)（PDB ID：6O3C）結(jié)構(gòu)的比較

B.?根據(jù)本研究確定的apo狀態(tài)結(jié)構(gòu)計(jì)算的配體結(jié)合袋

C.?相比之下，活性狀態(tài)下SMO的配體結(jié)合口袋（PDB ID: 6O3C）與激動(dòng)劑SAG21k結(jié)合，口袋底部有一個(gè)膽固醇

D.?本研究確定的SMO apo結(jié)構(gòu)的原子模型（藍(lán)絲帶）與以前確定的（PDB ID: 5L7D）重疊，沒(méi)有配體但CRD中結(jié)合有膽固醇。兩者之間的明顯差異表明，雖然兩個(gè)結(jié)構(gòu)都是apo狀態(tài)，但它們可能呈現(xiàn)apo SMO的兩種不同的中間狀態(tài)?

E.??b、c所示結(jié)構(gòu)的疊加。

F.?位于mSMO內(nèi)側(cè)小葉的膽固醇的密度

G.?通過(guò)表面視圖強(qiáng)調(diào)的甾醇位點(diǎn)

H. ?與g中看到的觀點(diǎn)相同，顯示從非活性狀態(tài)到活性狀態(tài)的構(gòu)象變化對(duì)甾醇結(jié)合的影響」

我們將我們的脂質(zhì)包埋apo SMO的結(jié)構(gòu)與先前確定的使用脂質(zhì)立方相方法解出的未配位SMO的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：5L7D）14進(jìn)行了比較。

這個(gè)先前的結(jié)構(gòu)解決了CRD與膽固醇結(jié)合的問(wèn)題，但在7TM內(nèi)沒(méi)有明確的膽固醇密度。與這個(gè)結(jié)構(gòu)和SMO的活性狀態(tài)結(jié)構(gòu)（PDB ID：6O3C）相比，我們發(fā)現(xiàn)7TM區(qū)域有細(xì)微但重要的差異。首先，7TM口袋中的幾個(gè)殘基重新排列，包括Y398（人類(lèi)SMO（hSMO）中的Y394）、R404（hSMO中的R400）和F488（hSMO中的F484）（圖4d，e和補(bǔ)充圖8e）。這導(dǎo)致了較小的口袋體積（1630 vs 2292 ?3）。第二，我們發(fā)現(xiàn)在7TM束外有一個(gè)與TM5和TM6相鄰的密度，面向質(zhì)膜的內(nèi)葉，其形狀和大小與甾醇一致（圖4f）。

分辨率排除了特定甾醇的分配，并且不清楚該密度是代表內(nèi)源性甾醇還是在saposin重建過(guò)程中添加的膽固醇。然而，鑒于在我們的重組中使用了高濃度的膽固醇，我們暫且在這個(gè)部位建立了膽固醇模型。據(jù)我們所知，以前在SMO的X射線或冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中沒(méi)有觀察到類(lèi)似部位的脂質(zhì)密度。模型中的膽固醇結(jié)合在由TM5的殘基L423和V427以及TM6的L454和F461形成的疏水縫隙中。TM5中殘基K434的側(cè)鏈可能與膽固醇的羥基相互作用（圖4f）。值得注意的是，F(xiàn)461（hSMO中的F457）重新定向以適應(yīng)膽固醇在該部位的結(jié)合（圖4g）。與SMO的活性狀態(tài)結(jié)構(gòu)比較表明，這個(gè)縫隙在受體激活時(shí)被破壞（圖4a和h），表明這個(gè)部位只存在于非活性或預(yù)活性狀態(tài)15。最后，膽固醇的異辛基尾巴面對(duì)著脂質(zhì)雙層的內(nèi)頁(yè)和活性SMO的7TM口袋之間的隧道開(kāi)口（圖4a，c）。

這些結(jié)構(gòu)觀察使我們推測(cè)，甾醇在該部位的結(jié)合可能對(duì)Hedgehog途徑的功能很重要。我們提出，膽固醇在通路激活時(shí)最初在SMO的這個(gè)部位結(jié)合。TM5和TM6的進(jìn)一步構(gòu)象變化將膽固醇擠出該部位，這樣它就可以翻轉(zhuǎn)并通過(guò)進(jìn)入TM5和TM6之間的開(kāi)放隧道到達(dá)TM束內(nèi)的膽固醇結(jié)合部位。

雖然是推測(cè)性的，但我們的建議擴(kuò)展了新出現(xiàn)的模型，即小葉內(nèi)側(cè)膽固醇水平受Patched-1的調(diào)節(jié)，而途徑的激活導(dǎo)致小葉內(nèi)側(cè)膽固醇的增加，并被SMO所感知?15,16,17,35。

| Discussion 討論?|

冷凍電鏡在GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用大大加快了GPCR信號(hào)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的確定。

然而，由于無(wú)法對(duì)準(zhǔn)單個(gè)顆粒，確定非復(fù)合物受體的結(jié)構(gòu)仍然很困難。從融合蛋白在晶體學(xué)中的應(yīng)用和通過(guò)冷凍電鏡確定hFzd5的結(jié)構(gòu)中得到啟發(fā)，我們開(kāi)始審視現(xiàn)有的策略，并為GPCR冷凍電鏡結(jié)構(gòu)建立新的融合策略。

值得一提的是，在GPCRs中加入融合蛋白的目的只是為了提供一個(gè)基準(zhǔn)標(biāo)記，以方便圖像對(duì)準(zhǔn)，而不是為了減少蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)或提高穩(wěn)定性，這也影響了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的可實(shí)現(xiàn)的分辨率。因此，我們把重點(diǎn)放在通過(guò)突變或拮抗劑穩(wěn)定的GPCRs上。

我們首先在兩個(gè)模型GPCRs，A2AR和SMO上測(cè)試BRIL-融合策略。先前解決的BRIL融合構(gòu)建體的X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)顯示，A2AR-BRIL在受體和BRIL之間形成兩個(gè)連續(xù)的螺旋，而SMO-BRIL只形成一個(gè)連續(xù)的螺旋。對(duì)于A2AR，使用抗BRIL的Fab使圖像對(duì)準(zhǔn)產(chǎn)生了受體及其藥物結(jié)合袋的高分辨率重建。然而，在沒(méi)有Fab的情況下，粒子對(duì)準(zhǔn)失敗。對(duì)于SMO，無(wú)論是單獨(dú)的BRIL融合還是BRIL融合加上抗BRIL Fab，都無(wú)法實(shí)現(xiàn)高分辨率的重建。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有大型穩(wěn)定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的GPCRs，BRIL-融合方法既需要BRIL和受體之間的剛性連接物，如具有兩個(gè)連續(xù)的螺旋或一個(gè)由另一個(gè)優(yōu)化的連接物支持的連續(xù)螺旋，如EBI2的最新研究中所證明的37,38，還需要一個(gè)額外的Fab來(lái)擴(kuò)大基準(zhǔn)標(biāo)記的尺寸。

在確定了BRIL-融合策略的制約因素后，我們?cè)噲D測(cè)試一種新的融合策略，該策略對(duì)螺旋形融合點(diǎn)的內(nèi)在制約較少，并使用不同的靶標(biāo)。我們選擇將PGS納入mSMO的ICL3中，假設(shè)單一連續(xù)螺旋的結(jié)構(gòu)和PGS的大小足以促進(jìn)圖像對(duì)準(zhǔn)。

令人驚訝的是，我們了解到單一的連續(xù)螺旋仍是不夠的。相反，沒(méi)有螺旋特性的延伸允許SMO和PGS之間有穩(wěn)定的疏水接觸，這獨(dú)立地使粒子對(duì)準(zhǔn)和最終重建SMO 7TM結(jié)構(gòu)域達(dá)到3.7?的分辨率。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種通過(guò)冷凍電鏡確定GPCR結(jié)構(gòu)的替代策略。

我們的A2AR和mSMO的結(jié)構(gòu)提供了關(guān)于脂質(zhì)如何與這兩種受體相互作用的結(jié)構(gòu)見(jiàn)解。對(duì)于A2AR，我們的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示了與TM5和TM6之間的受體結(jié)合的推定的磷脂酰絲氨酸。這種脂質(zhì)在以前解決的任何A2AR的X射線結(jié)構(gòu)中都沒(méi)有被觀察到。對(duì)于SMO，我們?cè)谥|(zhì)環(huán)境中的非活性受體的結(jié)構(gòu)顯示了與以前發(fā)表的X射線晶體和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)細(xì)微但重要的構(gòu)象差異。此外，該結(jié)構(gòu)揭示了TM5和TM6之間的甾醇結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)案例突出了冷凍電鏡在闡明GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的潛在效用。

除了最近的納米抗體策略，通過(guò)識(shí)別嫁接的細(xì)胞內(nèi)環(huán)12，我們的研究強(qiáng)調(diào)了GPCR和融合蛋白之間的剛性耦合對(duì)于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)測(cè)定的重要性。我們展示了兩種替代方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這種剛性。

一種是將融合蛋白連接到具有兩個(gè)延伸螺旋的GPCR上，通常是TM5和TM6。在連接GPCR和融合蛋白的一個(gè)連接點(diǎn)上的單一延伸螺旋不可能產(chǎn)生足夠的剛性來(lái)驅(qū)動(dòng)圖像對(duì)準(zhǔn)以進(jìn)行高分辨率的結(jié)構(gòu)測(cè)定，特別是當(dāng)另一個(gè)連接點(diǎn)不是剛性的而是長(zhǎng)的和/或靈活的。如果TM5和TM6都能作為延伸的螺旋體直接連接到融合蛋白上，就像A2AR-BRIL的情況一樣，插入物可能有足夠的剛性來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可能會(huì)進(jìn)一步促成這種設(shè)計(jì)。

另一種意想不到的方法是，融合蛋白可以通過(guò)其他特異性相互作用與GPCR穩(wěn)定地相互作用，如PGS和mSMO之間的疏水作用。在這種情況下，僅PGS的大小就足以驅(qū)動(dòng)圖像排列。值得注意的是，mSMO中與PGS相互作用的疏水殘基在許多其他GPCRs中是保守的，這表明PGS融合蛋白可以更廣泛地用于其他GPCRs的結(jié)構(gòu)研究。有趣的是，mSMO-PGS1和mSMO-PGS2代表了PGS融合域相對(duì)于GPCRs TM域的兩種構(gòu)型，這兩種構(gòu)型都出現(xiàn)在以前發(fā)表的多個(gè)GPCRs晶體結(jié)構(gòu)中28,29,31,32。

我們?cè)诖颂岢龅难芯勘砻鳎瑑烧咧兄挥幸粋€(gè)可以促進(jìn)圖像的排列。因此，當(dāng)把這種方法應(yīng)用于其他GPCRs時(shí)，有必要嘗試多種連接物的設(shè)計(jì)以獲得所需的連接物。因此，我們對(duì)融合蛋白策略的探索使沒(méi)有共同復(fù)合信號(hào)蛋白的GPCR的結(jié)構(gòu)測(cè)定成為可能，從而為理解GPCR結(jié)構(gòu)、功能和最終的藥物設(shè)計(jì)開(kāi)辟了新的途徑。

| Methods 方法?|??

此部分從略

| Reference 相關(guān)文獻(xiàn)?|??

1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. & Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature 459, 356–363 (2009).

2. Gurevich, V. V. & Gurevich, E. V. GPCR signaling regulation: the role of GRKs and arrestins. Front. Pharmacol. 10, 125 (2019).

3. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B. & Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 829–842 (2017).

4. Chun, E. et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure 20, 967–976 (2012).

5. Rosenbaum, D. M. et al. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science 318, 1266–1273 (2007).

6. Cheng, Y. Single-particle Cryo-EM at crystallographic resolution. Cell 161, 450–457 (2015).

7. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A. & Walz, T. A primer to singleparticle cryo-electron microscopy. Cell 161, 438–449 (2015).

8. Wu, S. et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure 20, 582–592 (2012).

9. Du, J. et al. Structures of human mGlu2 and mGlu7 homo- and heterodimers. Nature 594, 589–593 (2021).

10. Josephs, T. M. et al. Structure and dynamics of the CGRP receptor in apo and peptide-bound forms. Science https://doi.org/10.1126/ science.abf7258 (2021).

11. Koehl, A. et al. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature 566, 79–84 (2019).

12. Robertson, M. J. et al. Structure determination of inactive-state GPCRs with a universal nanobody. bioRxiv https://doi.org/10.1101/ 2021.11.02.466983 (2022).

13. Tsutsumi, N. et al. Structure of human Frizzled5 by fiducialassisted cryo-EM supports a heterodimeric mechanism of canonical Wnt signaling. elife https://doi.org/10.7554/eLife. 58464 (2020).

14. Byrne, E. F. X. et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature 535, 517–522 (2016).

15. Deshpande, I. et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives Hedgehog pathway activity. Nature 571, 284–288 (2019).

16. Huang, P. et al. Structural basis of smoothened activation in hedgehog signaling. Cell 174, 312–324.e316 (2018).

17. Qi, X., Friedberg, L., De Bose-Boyd, R., Long, T. & Li, X. Sterols in an intramolecular channel of Smoothened mediate Hedgehog signaling. Nat. Chem. Biol. 16, 1368–1375 (2020).

18. Qi, X. et al. Cryo-EM structure of oxysterol-bound human Smoothened coupled to a heterotrimeric Gi. Nature 571, 279–283 (2019).

19. Wang, C. et al. Structural basis for Smoothened receptor modulation and chemoresistance to anticancer drugs. Nat. Commun. 5, 4355 (2014).

20. Wang, C. et al. Structure of the human smoothened receptor bound to an antitumour agent. Nature 497, 338–343 (2013).

21. Weierstall, U. et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).

22. Zhang, X. et al. Crystal structure of a multi-domain human smoothened receptor in complex with a super stabilizing ligand. Nat. Commun. 8, 15383 (2017).

23. Mukherjee, S. et al. Synthetic antibodies against BRIL as universal fiducial marks for single-particle cryoEM structure determination of membrane proteins. Nat. Commun. 11, 1598 (2020).

24. Liu, W. et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science 337, 232–236 (2012).

25. Yen, H. Y. et al. PtdIns(4,5)P2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature 559, 423–427 (2018).

26. Myers, B. R., Neahring, L., Zhang, Y., Roberts, K. J. & Beachy, P. A. Rapid, direct activity assays for Smoothened reveal Hedgehog pathway regulation by membrane cholesterol and extracellular sodium. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, E11141–E11150 (2017).

27. Frauenfeld, J. et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat. Methods 13, 345–351 (2016).

28. Shao, Z. et al. High-resolution crystal structure of the human CB1 cannabinoid receptor. Nature 540, 602–606 (2016).

29. Yin, J. et al. Structure and ligand-binding mechanism of the human OX1 and OX2 orexin receptors. Nat. Struct. Mol. Biol. 23, 293–299 (2016).

30. Jumper, J. et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature 596, 583–589 (2021).

31. Yu, J. et al. Determination of the melanocortin-4 receptor structure identifies Ca(2+) as a cofactor for ligand binding. Science 368, 428–433 (2020).

32. Stauch, B. et al. Structural basis of ligand recognition at the human MT1 melatonin receptor. Nature 569, 284–288 (2019).

33. Khaliullina, H., Bilgin, M., Sampaio, J. L., Shevchenko, A. & Eaton, S. Endocannabinoids are conserved inhibitors of the Hedgehog pathway. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 3415–3420 (2015).

34. Niyaz, M., Khan, M. S. & Mudassar, S. Hedgehog signaling: an Achilles’ Heel in cancer. Transl. Oncol. 12, 1334–1344 (2019).

35. Zhang, Y. et al. Structural basis for cholesterol transport-like activity of the hedgehog receptor patched. Cell 175, 1352–1364.e1314 (2018).

36. Arveseth, C. D. et al. Smoothened transduces Hedgehog signals via activity-dependent sequestration of PKA catalytic subunits. PLoS Biol. 19, e3001191 (2021).

37. Chen, H., Huang, W. & Li, X. Structures of oxysterol sensor EBI2/ GPR183, a key regulator of the immune response. Structure https:// doi.org/10.1016/j.str.2022.04.006 (2022).

38. Liang, Y. L. et al. Phase-plate cryo-EM structure of a class B GPCRG-protein complex. Nature 546, 118–123 (2017).

39. Gao, Y., Cao, E., Julius, D. & Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature 534, 347–351 (2016).

40. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y. & Walz, T. Negative staining and image classification—powerful tools in modern electron microscopy. Biol. Proced. Online 6, 23–34 (2004).

41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36–51 (2005).

42. Zheng, S. Q. et al. MotionCor2: anisotropic correction of beaminduced motion for improved cryo-electron microscopy. Nat. Methods 14, 331–332 (2017).

43. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J. & Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat. Methods 14, 290–296 (2017).

44. Dang, S. et al. Cryo-EM structures of the TMEM16A calciumactivated chloride channel. Nature 552, 426–429 (2017).

45. Rosenthal, P. B. & Henderson, R. Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in singleparticle electron cryomicroscopy. J. Mol. Biol. 333, 721–745 (2003).

46. Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research and analysis. J. Comput Chem. 25, 1605–1612 (2004).

47. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G. & Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 486–501 (2010).

48. Afonine, P. V. et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 74, 531–544 (2018).

49. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 74, 519–530 (2018).

50. Goddard, T. D. et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Sci. 27, 14–25 (2018).

51. Berman, H., Henrick, K. & Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat. Struct. Biol. 10, 980 (2003).

| 詞表 |

1. 激動(dòng)劑

一種通過(guò)增加受體活性以產(chǎn)生生物反應(yīng)的物質(zhì)。

2. 拮抗劑(也稱(chēng)中性拮抗劑)

一種能阻斷激動(dòng)劑或反向激動(dòng)劑的物質(zhì)，在不存在激動(dòng)劑或反向激動(dòng)劑的情況下便沒(méi)有活性

3. 生物制藥

在生物活體中制造的藥物，可能含有重組蛋白、糖類(lèi)、基因療法或核酸。

4. 電子密度圖

電子密度與晶體中每一個(gè)晶胞位置的關(guān)系圖，以二維或三維表示，由解析X射線衍射圖案得出。

5. 靜電勢(shì)圖(即庫(kù)侖勢(shì)圖)

即樣品中電荷分布的二維或三維表示。在電子顯微鏡中，靜電勢(shì)圖由電子被與樣品相互作用時(shí)產(chǎn)生的庫(kù)侖力散射而產(chǎn)生。

6. 反向激動(dòng)劑

一種通過(guò)減少受體的基礎(chǔ)活性以產(chǎn)生生物反應(yīng)的物質(zhì)。

7. 脂質(zhì)立方相結(jié)晶

基于脂立方相的蛋白結(jié)晶技術(shù)，采用脂立方相模擬生物膜環(huán)境，膜蛋白可以在脂質(zhì)雙分子層中相互接觸，在合適的條件下形成晶體。

8. 脂質(zhì)納米盤(pán)

一個(gè)紐扣電池形狀的盤(pán)狀脂質(zhì)雙層，由兩個(gè)環(huán)繞的兩親性螺旋蛋白(膜支架蛋白)穩(wěn)定并使其可溶于水。

9. 冷凍電鏡負(fù)染

一種將重金屬鹽染色劑嵌入并固定在生物標(biāo)本上，并在室溫下進(jìn)行電子顯微鏡成像的技術(shù)方法。盡管只能在低分辨率(~2納米)下觀察標(biāo)本的形狀，但這種技術(shù)對(duì)于簡(jiǎn)單和快速評(píng)估樣品質(zhì)量是很有價(jià)值的。

水木未來(lái)丨視界 iss. 25