今天是第七天，我們將從植物生長促進(jìn)的細(xì)菌開始談起，這些細(xì)菌我們稱之為PGPRS。微生物群落的定義是所有微生物的集合，而微生物指的是微生物組成的生活環(huán)境。植物微生物群落包括與植物相關(guān)的所有細(xì)菌和微生物。生物之間從未獨(dú)處，它們總是與其他生物一起生活在地球上，這就是微生物群落。在農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域，有一個特殊的微生物群落，我們稱之為根際微生物群落，是指植物根際的細(xì)菌。PGPRS是一類能促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌，可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、增強(qiáng)根系和莖的生長，被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯、甜菜、蘿卜等作物以及草坪草。

PGPRS最早由Dr. Clapper在1980年發(fā)現(xiàn)，他發(fā)現(xiàn)了根瘤菌屬細(xì)菌，這些細(xì)菌會分泌出一種叫做鐵載體的化學(xué)物質(zhì)，可以將土壤中的鐵離子結(jié)合起來，從而防止植物病原菌感染植物。PGPRS分為三個類別：生物保護(hù)劑、生物肥料和生物刺激劑。生物保護(hù)劑可以抑制植物病害、增強(qiáng)植物免疫系統(tǒng)，生物肥料可以增強(qiáng)土壤養(yǎng)分、固定氮素，提高植物的生長和產(chǎn)量。氮素在生物體內(nèi)主要用于合成蛋白質(zhì)，因此氮固定對于植物的生長十分重要。

PGPRs能夠通過三種方式幫助作物生長，分別是肥料作用、生長刺激作用和激素合成作用。常見的PGPRs包括芽孢桿菌、假單胞菌等。這些菌可以通過篩選和培養(yǎng)來開發(fā)成對特定作物有益的PGPRs。在開發(fā)過程中，首先需要收集植物生長最好的土壤，然后進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，最終形成產(chǎn)品。由于PGPRs大多數(shù)是革蘭氏陽性菌，因此可以形成芽孢，具有較長的貨架壽命，方便存儲和銷售。此外，PGPRs還可以通過固氮和轉(zhuǎn)化磷等作用，為作物提供生長所需的氮和磷元素。其中包括從土壤中分離PGPR的方法和問題、PGPR在不同環(huán)境中的適應(yīng)性問題、PGPR的性質(zhì)和對作物的影響，以及如何基因工程PGPR以實(shí)現(xiàn)雙重功能。其中，存在著大量未被研究的菌株，多數(shù)PGPR的生長受到環(huán)境因素的制約，PGPR的應(yīng)用可能會受到限制，如存在人體致病菌。對于雙重功能的PGPR，需要找到適合的菌株來促進(jìn)草坪生長，并能殺死草坪害蟲。其中，通過工程菌株來殺死害蟲需要尋找并利用能殺蟲的蛋白質(zhì)，例如誘導(dǎo)蟲體凋亡的蛋白質(zhì)。

關(guān)于如何利用不同的基因工程技術(shù)來制造能殺死昆蟲的細(xì)菌。提到的技術(shù)包括plasmid、homologous recombination、transposon以及CRISPR-Cas9等。首先，要選擇一個合適的載體，并在載體上插入cry protein基因和適當(dāng)?shù)膯幼?，以激活cry protein的表達(dá)。但是，由于細(xì)菌不會一直保留plasmid，因此使用plasmid不是最好的選擇。相反，可以使用homologous recombination或transposon等技術(shù)，將cry protein基因插入到細(xì)菌染色體上，并使其穩(wěn)定地保留在染色體上。另外，對話中還簡要介紹了如何使用CRISPR-Cas9技術(shù)向細(xì)菌中插入cry protein基因，需要設(shè)計(jì)合適的引導(dǎo)RNA、修復(fù)模板等，最后將這些基因和模板導(dǎo)入到細(xì)菌中。

基因組編輯可以通過使用轉(zhuǎn)座子或CRISPR系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)座子可以隨機(jī)插入基因，而CRISPR系統(tǒng)則具有更精準(zhǔn)的定位特性。選擇哪種方法取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮脱芯空叩慕?jīng)驗(yàn)。重組蛋白表達(dá)的目標(biāo)是將某個生物體中的DNA移植到另一個生物體中，使得后者能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白。這個技術(shù)可以用于生產(chǎn)酶、藥物和研究蛋白質(zhì)相互作用等方面。E. coli是一種常用的表達(dá)宿主，因?yàn)樗L速度快且成本低。不同的表達(dá)菌株具有不同的基因型和表達(dá)特性，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。討論了大腸桿菌（E. coli）在生產(chǎn)蛋白質(zhì)時可能出現(xiàn)的問題以及解決方法。以下是主要學(xué)習(xí)要點(diǎn)的中文總結(jié)：大腸桿菌可能含有蛋白酶（protease），它會將蛋白質(zhì)剪切成碎片，導(dǎo)致無法生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。為了避免這種情況發(fā)生，可以通過刪除編碼蛋白酶的基因，如P，來避免蛋白質(zhì)被剪切。Arabinos Operan是一種能夠降解糖分子arabinose的酶，如果大腸桿菌含有該酶，會導(dǎo)致表達(dá)的基因被關(guān)閉。因此，可以使用BL21AI，它的染色體中刪除了Arabinos Operan，從而可以通過添加arabinose來激活所需的基因。Rosetta菌株是從BL21細(xì)胞中分離出的，它通過額外的質(zhì)粒P rare來過度表達(dá)一些罕見的tRNA，從而提高了表達(dá)罕見密碼子的基因的效率。異源基因的密碼子使用可能與大腸桿菌不同，因此可以使用密碼子優(yōu)化的方法來改變密碼子序列，以適應(yīng)大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)。還有其他類型的表達(dá)系統(tǒng)，如真核生物系統(tǒng)，例如Picchia Pastorus，可以用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。為什么需要使用真核表達(dá)系統(tǒng)：真核系統(tǒng)可以進(jìn)行后轉(zhuǎn)錄修飾，如糖基化等，而大腸桿菌系統(tǒng)則不具備這個功能。最常見的誘導(dǎo)質(zhì)粒系統(tǒng)：包括乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)和阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)更緊密，不會發(fā)生泄漏，可以通過濃度調(diào)節(jié)進(jìn)行逐漸增加的誘導(dǎo)。細(xì)菌在表達(dá)蛋白時的生長曲線：細(xì)菌的生長呈指數(shù)增長，在中指數(shù)期是最適合表達(dá)蛋白的時期。過早或過晚的表達(dá)都會影響蛋白的表達(dá)量。如何測量細(xì)胞數(shù)：在細(xì)菌表達(dá)蛋白時，需要用到細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，常用的方法包括光密度測量和血細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。

蛋白表達(dá)通常需要對序列進(jìn)行編碼優(yōu)化，可以使用計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行優(yōu)化，或者從公司購買經(jīng)過編碼優(yōu)化的序列。不同的培養(yǎng)基可以影響蛋白的產(chǎn)量，常用的培養(yǎng)基有LB和TB。在進(jìn)行蛋白表達(dá)時，需要對培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，并使用稱為“Earlyn Meyer flask”的容器，放置在搖床上進(jìn)行氧氣供應(yīng)。蛋白表達(dá)后，需要進(jìn)行細(xì)胞破裂（lysis），以釋放蛋白?？梢允褂妹附夥?、超聲波法、法國壓等方法進(jìn)行破裂。在進(jìn)行蛋白純化時，可以使用親和層析技術(shù)，如鎳柱、鈷柱和谷胱甘肽柱（glutathion beads）進(jìn)行分離和純化。光密度法（spectral photometer）可以用于測量培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量的光學(xué)密度（OD），以確定添加 IPTG 等誘導(dǎo)劑的時間點(diǎn)。培養(yǎng)溫度通常為37°C，表達(dá)時間通常為4小時或過夜。建議對蛋白表達(dá)和純化過程進(jìn)行優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，以確保獲得高質(zhì)量的蛋白。

蛋白質(zhì)表達(dá)的純化和定量方法，以及T7系統(tǒng)的原理。純化方法包括使用標(biāo)簽結(jié)構(gòu)和柱層析，其中His6標(biāo)簽結(jié)構(gòu)可以結(jié)合鎳和鈷，GST標(biāo)簽結(jié)構(gòu)可以結(jié)合谷胱甘肽。定量方法包括Nano Drop、Bradford Assay和Densitometry。T7系統(tǒng)是一種利用T7噬菌體聚合酶和其自身啟動子的表達(dá)系統(tǒng)，可以避免Lac操作子泄漏的問題。該系統(tǒng)包括染色體和質(zhì)粒兩部分，質(zhì)粒上有Lac操作子啟動子和T7啟動子，染色體上有Lac抑制子和T7聚合酶基因。添加IPTG后，Lac抑制子會脫落，T7聚合酶開始表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。講述了重組蛋白表達(dá)的內(nèi)容。首先介紹了T7系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過T7聚合酶和T7啟動子來實(shí)現(xiàn)基因X的轉(zhuǎn)錄。其次，介紹了為什么需要使用T7系統(tǒng)，因?yàn)長ac操作子有些泄漏，而T7系統(tǒng)較為緊密。然后，介紹了Pbad質(zhì)粒和Ek切割酶識別位點(diǎn)，這些都是用于重組蛋白表達(dá)的。為了檢測重組蛋白是否表達(dá)，可以進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，通過比較帶有和不帶有誘導(dǎo)劑的樣本來得出結(jié)論。一些常見的問題包括蛋白表達(dá)不足或不穩(wěn)定，這些問題可能需要進(jìn)行優(yōu)化或添加標(biāo)簽。

討論了一些關(guān)于重組蛋白表達(dá)過程中常見的問題以及解決方法。主要的問題包括污染物、蛋白質(zhì)在表達(dá)過程中被降解、蛋白質(zhì)表達(dá)的可溶性不足等。解決方法包括添加可溶性標(biāo)簽、增加洗滌步驟、更換柱子、使用特殊的細(xì)胞株等等。此外，還介紹了兩步純化和大小排除色譜等常見的兩種純化方法。