第二十章：常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

第一節(jié)：分子雜交與印跡技術(shù)

分子雜交技術(shù)：利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)，結(jié)合印跡技術(shù)和探針技術(shù)，可進(jìn)行DNA和RNA定性或定量分析

（一）印跡技術(shù)

廣泛用于DNA，RNA和蛋白質(zhì)的檢測

（二）探針技術(shù)

探針：是指帶有特殊可檢測標(biāo)記的核酸片段，具有特定的序列，能夠與待測的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合，因此可用于檢測核酸樣品中存在的特定基因

二：印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

（一）DNA印跡

DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將含有DNA區(qū)段的凝膠在變性溶液中處理后，再DNA分子轉(zhuǎn)移到nc膜上并使之固定，即可用于雜交反應(yīng)。DNA印跡技術(shù)主要用于基因組DNA的定性和定量分析。

（二）RNA印跡

與DNA印跡原理相同，但轉(zhuǎn)移前無需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割，主要用于檢測某一特定組織或細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平

（三）蛋白質(zhì)印跡

混合蛋白質(zhì)先用聚丙烯酰胺凝膠電泳分開，在將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到nc膜上，再用第一抗體與膜上蛋白質(zhì)分子結(jié)合，然后用放射性核素標(biāo)記的第二抗體與之結(jié)合，最后用放射自顯影技術(shù)來檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在及特異性蛋白質(zhì)的半定量分析等

第二節(jié)：PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

Pcr=聚合酶鏈反應(yīng)：可將微量的目的DNA片段大量擴(kuò)增。

一：pcr技術(shù)的工作原理

Pcr：以需要擴(kuò)增的DNA分子為模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制機(jī)制，完成DNA的復(fù)制。重復(fù)這一過程，可是目的基因DNA片段的到擴(kuò)增

過程：

1.變性：將反應(yīng)體系加熱到94度，使模板DNA雙鏈完全變性稱為單鏈

2.退火：將溫度下降到適宜溫度，使引物與模板DNA結(jié)合

3.延伸：溫度升高至72度，DNA聚合酶以dntp為底物催化DNA的合成反應(yīng)

以上三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，多次循環(huán)即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。

基因文庫和cDNA文庫有何不同？為什么要建立cDNA文庫？

基因文庫是指整套基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆之總和，cDNA文庫是指細(xì)胞全部mrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和，cDNA組成特點(diǎn)是不含內(nèi)含子和其他調(diào)控序列。

真核生物的基因是斷裂的，需經(jīng)過rna轉(zhuǎn)錄加工才能使編碼序列拼接在一起，真核生物的基因不能直接在原核生物中表達(dá)，只有加工成熟的mrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA接上原核生物表達(dá)控制元件才能在原核生物中表達(dá)。另外，真核生物細(xì)胞中只有一小部分mrna表達(dá)，mrna的穩(wěn)定性差，因此，需構(gòu)建cDNA文庫，用于基因表達(dá)等方面的研究。

第四節(jié)：生物芯片技術(shù)

一：基因芯片

是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一個(gè)位點(diǎn)的熒光信號序列做出檢測，比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。

二：蛋白質(zhì)芯片

將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。