第十四章 基因重組和基因工程?

一、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組：?

基因重組(gene recombination)是指DNA片段在細胞內(nèi)、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能。?

1．接合作用：當細胞與細胞相互接觸時，DNA分子即從一個細胞向另一個細胞轉(zhuǎn)移，這種遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方式稱為接合作用（conjugation）。?

2．轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：由外來DNA引起生物體遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。噬菌體常?？筛腥炯毦⑵銬NA注入細菌體內(nèi)，也可引起細菌遺傳性狀的改變。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。?

3．整合和轉(zhuǎn)導:外來DNA侵入宿主細胞，并與宿主細胞DNA進行重組，成為宿主細胞DNA的一部分，這一過程稱為整合。整合在宿主細胞染色體DNA中的外來DNA，可以被切離出來，同時也可帶走一部分的宿主DNA，這一過程稱為轉(zhuǎn)導(transduction)。來源于宿主DNA的基因稱為轉(zhuǎn)導基因。?

4．轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座又稱為轉(zhuǎn)位（transposition），是指DNA的片段或基因從基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位

置的現(xiàn)象。這些能夠在基因組中自由游動的DNA片段包括插入序列和轉(zhuǎn)座子兩種類型。?

⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是長750-1500bp的DNA片段，由兩個分離的反向重復序列和一個轉(zhuǎn)座酶基因。當轉(zhuǎn)座酶基因表達時，即可引起該序列的轉(zhuǎn)座。其轉(zhuǎn)座方式主要有保守性轉(zhuǎn)座和復制性轉(zhuǎn)座。?

⑵轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座子(transposons)是可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一個位點的分散的重復序列，含兩個反向重復序列、一個轉(zhuǎn)座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。?

免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組恒定區(qū)基因（CH）構(gòu)成，通過這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組，就可以轉(zhuǎn)錄表達出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對付不同的抗原。?

5．基因重組的方式：?

⑴位點特異性重組：在整合酶的催化下，兩段DNA序列的特異的位點處發(fā)生整合并共價連接，稱為位點特異性重組。?

⑵同源重組：發(fā)生在同源DNA序列之間的重組稱為同源重組(homologous recombination)。這種重組方式要求兩段DNA序列類似，并在特定的重組蛋白或酶的作用下完成。?

二、重組DNA技術(shù)：?

重組DNA技術(shù)又稱為基因工程（genetic engineering）或分子克隆(molecular cloning)，是指采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程。?

1．載體和目的基因的分離（分）：對載體DNA和目的基因分別進行分離純化，得到其純品。?

⑴載體：常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。①質(zhì)粒：是存在于天然細菌體內(nèi)的一種獨立于細菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨立復制的能力，通常帶有細菌的抗藥基因。②噬菌體：可通過轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細菌體內(nèi)進行增殖。常用的為人工構(gòu)建的λ噬菌體載體，當目的基因與噬菌體DNA進行重組時，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。③病毒：常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動物細胞中進行增殖。?

⑵目的基因：①直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離。②人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。③從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。④從基因文庫中篩選：將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomic DNA library)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNA library)。C-文庫具有組織細胞特異性。⑤利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。?

2．載體和目的基因的切斷（切）：通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進行切斷，以便于重組。能夠識別特定的堿基順序并在特定的位點降解核酸的核酸內(nèi)切酶稱為限制酶。限制酶所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結(jié)構(gòu)。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesive end)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。?

3．載體和目的基因的重組（接）：即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。?

⑴粘性末端連接法：載體與目的基因通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。?

⑵人工接尾法：即同聚物加尾連接法。在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，通過堿基互補進行粘合后，再由DNA連接酶連接。?

⑶人工接頭連接法：將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。?

4．重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)）：將重組DNA導入宿主細胞進行增殖或表達。重組質(zhì)粒可通過轉(zhuǎn)化方式導入宿主細胞，λ噬菌體作為載體的重組體，則需通過轉(zhuǎn)染方式將重組噬菌體DNA導入大腸桿菌等宿主細胞。重組DNA導入宿主細胞后，即可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)以擴增宿主細胞。?

5．重組DNA的篩選和鑒定（篩）：對含有重組體的宿主細胞進行篩選并作鑒定。?

⑴根據(jù)重組體的表型進行篩選：對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。?

⑵根據(jù)標志互補進行篩選：當宿主細胞存在某種基因及其表達產(chǎn)物的缺陷時，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應(yīng)的缺陷基因，如宿主細胞重新獲得缺陷基因的表達產(chǎn)物，則說明該細胞中帶有重組體。?

⑶根據(jù)DNA限制酶譜進行分析：經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。?

⑷用核酸雜交法進行分析鑒定：采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，以確定重組體中帶目的基因。?

獲得帶目的基因的細菌后，可將其不斷進行增殖，從而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游帶有啟動子順序，則目的基因還可轉(zhuǎn)錄表達合成蛋白質(zhì)