何光存教授PNAS發(fā)文點評害蟲防治中的葉綠體工程

迄今為止，大約鑒定了100萬種昆蟲，其中有一半是食草昆蟲，這些昆蟲對農(nóng)作物造成了嚴重的危害。盡管人們在害蟲防治的過程中，付出了巨大的努力，甚至是使用了數(shù)十億磅的化學殺蟲劑，但是在全球范圍內(nèi)，尤其是在發(fā)展中國家，害蟲依然是造成作物損失的關(guān)鍵因素。隨著全球變暖這一影響不斷加劇，溫度每升高一度，產(chǎn)量損失將增加10%至25%。因此，我們需要制定創(chuàng)新、有效、環(huán)保的作物保護戰(zhàn)略以保障全球糧食安全。其中一種新興的作物保護方法是將葉綠體作為“轉(zhuǎn)質(zhì)體” 修飾其潛在位點，從而保護植物免受植食性昆蟲的侵害。

葉綠體來自藍細菌，包含自己的基因組(質(zhì)體DNA)，這為通過利用同源重組(HR)精確插入的轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了機會。與核基因組不同的是，葉綠體基因組缺乏表觀遺傳效應(yīng)，并且在植物細胞中以高拷貝數(shù)存在。因此，葉綠體為導(dǎo)入基因的超高水平表達提供了可能。利用這種方案，用于害蟲控制的轉(zhuǎn)質(zhì)體技術(shù)的第一個應(yīng)用案例是在煙草葉綠體中表達蘇云金芽孢桿菌cry1A(c)基因。轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草植物中積累了大量的cry1A(c)，其表達產(chǎn)物可達到總可溶性蛋白的3-5%，并且，這種轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草植物對幾種害蟲呈現(xiàn)了強抗性。除了煙草，表達cry基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體大豆和楊樹也顯示出強烈的殺蟲活性。??

另一種新興的害蟲控制方法使用RNA干擾(RNAi)，這是一種存在于幾乎所有真核生物中的調(diào)節(jié)機制，其中雙鏈RNA (dsRNA)產(chǎn)生小干擾RNA(siRNA)，介導(dǎo)具有互補序列的信使RNA (mRNA)的破壞，從而沉默感興趣的基因。當靶向必需昆蟲基因的dsRNA在植物中表達并在喂食后通過腸道被昆蟲吸收時， RNAi抑制靶向基因的表達，導(dǎo)致害蟲生長受損和死亡。Mao等人和Baum等人最早描述了利用整合到核基因組中的轉(zhuǎn)基因表達的RNAs來控制害蟲的基于RNAi的策略。

昆蟲RNAi需要有效攝取長dsRNAs或發(fā)夾RNA(hpRNAs)。然而，在細胞核中表達的dsRNA可能被植物的內(nèi)源性RNAi機制加工成siRNA，降低了其飼喂給昆蟲時的效果，因此，這種方案在田間可能提供不了足夠的保護。植物葉綠體缺乏RNAi機制，使它們非常適合表達dsRNA來實現(xiàn)昆蟲中的RNAi。事實上，張等人通過在馬鈴薯葉綠體中表達dsRNA證明了這一方案在害蟲控制策略中的可行性。

農(nóng)業(yè)害蟲為了適應(yīng)不同的食物來源，進化出了不同的進食方式。在PNAS這項研究中，Wu等人使用葉綠體表達的dsRNA來控制非咀嚼式口器昆蟲西花薊馬（WFT）;?西花薊馬是一種破壞性極強的害蟲，同時，它還是一種傳遞病毒的載體(圖1)。西花薊馬具有刺吸式口器，用來攝取植物細胞并吸食細胞內(nèi)容物，造成植物細胞崩潰，損害植物生存。此外，WFT傳播多種植物病毒，例如番茄斑萎病毒，該病毒每年在全世界造成超過10億美元的損失。WFT的化學防治需要使用噴霧設(shè)備進行多次葉面噴灑，以確保良好的覆蓋和滲透到薊馬取食的部位。同時，大多數(shù)WFTs在土壤中化蛹，所以還必須向地面施用殺蟲劑。對主要殺蟲劑的耐藥性的產(chǎn)生也使利用化學方法控制WFTs具有困難。

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薊馬攝取包括葉綠體在內(nèi)的植物細胞的內(nèi)容物，說明轉(zhuǎn)質(zhì)體dsRNA可能是一種有效的防治策略。為了證實WFT能在葉綠體中攝取dsRNA，分別以表達棉鈴蟲NADH?脫氫酶泛素黃蛋白2基因dsRNA的人工飼料、野生型(WT)植物和跨質(zhì)體煙草植物喂食并進行RT-PCR，結(jié)果表明，這些昆蟲取食轉(zhuǎn)基因植株葉片時，會吸收葉綠體表達的dsRNA。

接下來，Wu等人構(gòu)建了含有dsRNAs和hpRNAs的結(jié)構(gòu)體，靶向WFT的四個關(guān)鍵基因:ACT、TUB、VAT和SNF。這些構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化到葉綠體基因組或核基因組中，分別生成跨質(zhì)體和核轉(zhuǎn)基因植株。據(jù)估計，dsRNAs占轉(zhuǎn)基因植株總RNA水平的約0.4 ~ 1%，hpRNAs占轉(zhuǎn)基因植株總RNA水平的約0.4 ~ 0.8%。令人驚訝的是，transplasomic系的dsRNA和hpRNA水平比核轉(zhuǎn)基因植物高4個數(shù)量級。3天后，與野生型和對照相比，取食表達dsRNA或hpRNA的轉(zhuǎn)基因植株后，4個基因均被顯著抑制。而大多數(shù)取食核轉(zhuǎn)基因株系的WFT中，目的基因的表達沒有顯著影響。

作者通過生物測定和檢查植物癥狀來評估轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物對WFT的抗性水平。他們觀察到，與野生型植株相比，取食轉(zhuǎn)基因植株葉片的幼蟲死亡率明顯更高。轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲性比核轉(zhuǎn)基因株系強得多。葉片損傷分析驗證了這些品系的抗性水平。與轉(zhuǎn)基因植株相比，WFTs對野生型和對照植株葉片的損傷要嚴重得多。對整株幼苗的表型分析證實，跨質(zhì)體植株的抗性越強，對WFTs的防治效果就越好，這可能是由于葉綠體中產(chǎn)生了高水平的dsRNA和hpRNA。

編碼具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子剪接RNA?的基因構(gòu)建體可以提高RNAi?的效率。表達以棉鈴蟲乙酰膽堿酯酶基因為靶點的hpRNAs的轉(zhuǎn)基因植株對昆蟲取食表現(xiàn)出較強的抗性。葉綠體表達的dsRNA和hpRNA有效地抑制了目標基因，導(dǎo)致昆蟲高死亡率。然而，hpRNA的構(gòu)建引起葉綠體基因組的不穩(wěn)定性，這表明dsRNA是更好的跨質(zhì)體RNAi。除了白斑翅目外，許多其他目昆蟲也是經(jīng)濟作物和糧食作物的害蟲;?最著名的是Stenchaetothrips biformis,Scirtothrips?dorsalis,Thrips alliorum?和Haplothrips tritici。Wu等人提供了一種很有前途的策略來控制薊馬和其他非咀嚼式口器的害蟲，這是令人興奮的。

使用跨質(zhì)體RNAi方法的一個挑戰(zhàn)是擴大宿主范圍。葉綠體轉(zhuǎn)化已在20多種開花植物中報道。然而，到目前為止，只有不到10個物種可產(chǎn)生后代。已成功應(yīng)用葉綠體工程的植物是茄科植物，包括煙草、番茄、馬鈴薯、茄子和辣椒。將轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)推廣到谷物上，將提高我們控制嚴重害蟲的能力。通過對葉綠體生物學的基礎(chǔ)研究和葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破，可以成功轉(zhuǎn)化抗性谷物的葉綠體。

研究人員正在使用各種方法來改善谷物和其他植物的葉綠體工程。一般來說，谷物的葉片是不能培育和再生的。愈傷組織通過胚或幼穗分化，在含有2,4-二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因此，培養(yǎng)過程中會發(fā)生質(zhì)體DNA缺失。愈傷組織細胞中的質(zhì)體可能不能勝任外源DNA的整合。諸如調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生基因的表達等方法可以增強葉片和葉肉原生質(zhì)體的再生能力，并提高葉綠體在谷物中的能力。長期以來Biolistics一直是將?DNA?遞送到葉綠體中的唯一可重復(fù)方法。然而，最近引入了一種通過納米顆粒將質(zhì)粒?DNA?遞送到葉綠體中的新策略。葉綠體信號肽可以引導(dǎo)裝載化學物質(zhì)的納米材料進入葉綠體。Minisynplastomes 可以為將外源 DNA 輸送到葉綠體中提供工程平臺，這一最新的 DNA 遞送工具將提高其他作物中穩(wěn)定葉綠體轉(zhuǎn)化的能力和效率。

HR是將外來DNA整合到葉綠體基因組的關(guān)鍵步驟。HR取決于所攜帶的外源DNA序列與目標整合位點是否相同。全面了解作物葉綠體基因組的基因序列及其多樣性，將有助于高效的葉綠體工程系統(tǒng)的開發(fā)。在過去的幾十年里，篩選同形植物的選擇程序沒有太大變化。盡管已經(jīng)嘗試了幾種抗生素抗性基因，鏈霉素30-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(aadA)仍然是葉綠體轉(zhuǎn)化中使用最多的選擇標記基因。最近的一項研究顯示，編碼一個質(zhì)體靶向乙酰輔酶A羧化酶的ACC2的零突變會導(dǎo)致對大眼霉素的過敏。acc2背景下的葉綠體轉(zhuǎn)化效率比對照提高了約100倍，為抗性作物的葉綠體工程提供了有價值的信息。隨著抗蟲基因的使用和核轉(zhuǎn)化，葉綠體工程可能產(chǎn)生新的機會，以幫助保障糧食安全、人類健康和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)。

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https://doi.org/10.1073/pnas.2120081119.