免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 是一種用于檢測以及識別細胞和組織中蛋白質和其他分子的亞細胞分布和遷移的強大檢測技術,可用作免疫組織化學 (IHC) 或免疫細胞化學 (ICC) 中使用的傳統(tǒng)顯色標記的替代物。通過使用多種標記物的二級抗體，能夠研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過常規(guī)IHC或ICC實現(xiàn)的。IF優(yōu)勢在于可同時分析許多目標蛋白，同時生成大量亞細胞定位的準確數(shù)據(jù)。

實驗原理：

IF是根據(jù)抗原抗體反應原理，先將已知抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

直接法IF使用帶有偶聯(lián)熒光染料（共軛抗體）的一級抗體，間接法IF需同時使用可結合靶標抗原一抗和偶聯(lián)熒光染色的二抗。

實驗流程：

1. 樣本前處理（封閉前處理）

1.1 細胞樣本

i）細胞準備

①單層生長細胞：在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗滌；

②懸浮生長細胞：取對數(shù)生長細胞并用PBS離心洗滌，之后用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

ii）固定：根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌ㄈ缍嗑奂兹┕潭毎?，固定完畢的細胞可置于含疊氮化鈉的PBS中4℃保存。固定后用PBS洗滌3次。

iii）通透：使用固定劑固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質，并控制好通透的時間。通透后用PBS洗滌3次。

1.2?石蠟切片樣本

i）烤片：將石蠟切片按同一朝向放置在切片架上（一般用不銹鋼的，做跟鐵染色相關的可用塑料的），將其放入適宜溫度恒溫箱中烤片適宜時間，并同時將脫蠟液1缸一起放入恒溫箱中。

ii）脫蠟水化：將石蠟切片連同切片架一起放入脫蠟液1缸中，再一起從恒溫箱中取出置于常溫。冷卻一段時間后，將切片取出浸入到常溫脫蠟液2缸中，并按照脫蠟液2、脫蠟液3、無水乙醇1、無水乙醇2、無水乙醇3，也可以選擇梯度濃度（高濃度到低濃度）乙醇的順序依次將石蠟切片放入缸中適宜時間。脫蠟水化后用流水清洗切片。

iii）抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火加熱適宜時間后停火適宜時間，再轉中低火加熱適宜時間（此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片）。離開熱源自然冷卻后，將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定）。

1.3?冰凍切片樣本

i）固定：冰凍切片在適宜溫度下烘烤適宜時間，控干水分，置于多聚甲醛中固定適宜時間。PBS緩沖液中晃動洗滌3次，每次5分鐘。

ii）抗原修復：同石蠟切片。

iii）畫圈：切片稍甩干后，用組化筆在組織周圍畫圈。

2. 封閉

使用封閉液（如山羊血清）將樣本完全覆蓋，并置于適宜溫度恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育適宜時間（切片需置于濕盒內，細胞可直接置于密封好的孔板中）。

3. 免疫染色

i）一抗稀釋孵育：按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；吸走封閉液，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜。

ii）復溫洗滌：將樣本置于常溫復溫；用TBST緩沖液洗滌適宜時間以去除抗體工作液，再用TBST緩沖液洗滌3次。

iii）二抗稀釋孵育：按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；加入稀釋后的二抗，室溫避光孵育適宜時間。

4. 染核/封片

i）染色：在樣本上滴加DAPI工作液，避光室溫下孵育適宜時間。

ii）洗滌：用TBST緩沖液洗滌以去除DAPI工作液，再用TBS緩沖液洗滌3次。

iii）加入抗熒光衰減封片劑：細胞免疫熒光最好不封片。

5. 成像和數(shù)據(jù)收集

于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

實驗結果：

應用：

由于其具有特異性強、敏感性高、速度快等優(yōu)點，故可廣泛用于科學研究（如測定內分泌激素、蛋白質、多肽、核酸、神經(jīng)遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質）。隨著多重免疫熒光技術的興起和發(fā)展，在臨床診斷上的應用也越來越豐富（根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內分泌、腫瘤、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等）。

參考：

[1] 知乎-免疫熒光（IF）染色及優(yōu)化技巧

[2] 知乎-超全攻略 ！一文理清免疫熒光實驗步驟、技巧及疑難問題

[3] 知乎-石蠟切片和冰凍切片之高質量HE染色、免疫組化、免疫熒光染色

[4] 知乎-石蠟切片免疫熒光實驗報告及結果展示-上海鄭核

[5] 知乎-干貨分享 | 冰凍切片免疫熒光實驗流程

[6] 知乎-免疫熒光染色步驟和原理

[7] 知乎-一分鐘帶你了解免疫熒光技術步驟及原理（IF實驗）

[8] 搜狐-免疫熒光（Immunofluorescence, IF）實驗方法

[9] 知乎-超詳細免疫熒光染色實驗流程~