一、鱟變形細胞溶解物(limulus amocbocyte lysate,LAL)試驗

內毒素的檢測常用家兔熱原法和LAL試驗（簡稱為“鱟試驗”)法。家兔熱原法是檢測內毒素的第一種標準方法，鱟試驗法則是目前最常用的內毒素檢測方法。我國藥典收載的細菌內毒素檢測方法為鱟試驗法，包括2種方法，即凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基質法。當各種檢測法得到的檢測結果不一致時，以凝膠法的檢測結果為準。檢測過程中應防止內毒素污染。鱟試驗法檢測須使用鱟試劑。鱟試劑是從海洋節(jié)肢動物鱟的血液中提取其變形細胞溶解物、再經低溫冷凍干燥制成的一種生物試劑，其因能與內毒素和(1,3)-β-D-葡聚糖反應形成凝膠而被廣泛用于檢測食品、水源、藥品、醫(yī)療器械以及動物和人體體液等不同樣本中的內毒素。鱟的血液和淋巴液中有一種有核的變形細胞，這種細胞胞漿內有大量的致密顆粒，內含凝固酶、C-因子、B-因子和凝固蛋白原等。內毒素與鱟試劑接觸后可激活C-因子，激活的C-因子又可激活B-因子或由(1,3)-β-D-葡聚糖激活G-因子，激活的B-或G-因子可再激活凝固酶原，使之轉變?yōu)槟堂?，繼而使可溶性的凝固蛋白原轉變成凝固蛋白，由此使鱟試劑變?yōu)槟z狀態(tài)[1,2-3]。凝固酶對鱟三肽有酰氨酶活性，可使硝基苯胺游離而發(fā)生生色反應。鱟試驗法有定性和定量之分，其按試驗方法還可進一步分為凝膠法、動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色法和終點顯色法。

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凝膠法系應用鱟試劑可與內毒素發(fā)生凝集反應的原理來定性或半定量檢測內毒素的一種鱟試驗法，檢測時鱟試劑須以除熱原水（內毒素檢查用水）復溶后使用，通過觀察有無凝膠形成作為檢測終點。凝膠法檢測操作簡便、經濟，不需使用專用檢測設備。

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動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色法和終點顯色法都是內毒素的定量檢測方法。動態(tài)濁度法和終點濁度法都屬濁度法。濁度法是通過檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化來檢測內毒素含量的鱟試驗法，其中動態(tài)濁度法檢測反應混合物濁度升高至某一預先設定的吸光度時所需的時間或濁度升高的速率。

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動態(tài)顯色法和終點顯色法都屬顯色基質法。顯色基質法是通過檢測鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物游離出生色團的多少來檢測內毒素含量的鱟試驗法，根據產物色度計算內毒素水平，又被稱為比色法。

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動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法檢測都須有帶溫育系統的動態(tài)光度測定儀器及其配套軟件。動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法檢測操作簡便、線性范圍寬。終點顯色法檢測須有配套的酶標儀或可見分光光度儀。

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就定量檢測而言，比較同一個體內毒素水平的變化較比較不同個體或不同方法檢測到的內毒素水平的差異更有意義。內毒素可被捕獲在血凝塊中，因此選用血漿樣本檢測內毒素較選用血清樣本檢測更好〔檢測時建議使用低濃度肝素)。檢測時應防止環(huán)境內毒素的污染。

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定性鱟試驗法主要用于藥品、醫(yī)療器械等樣本的內毒素監(jiān)測。定量鱟試驗法主要用于臨床患者的內毒素檢測，為其臨床診治提供參考。一項研究顯示，對血液透析患者的內毒素檢測，動態(tài)濁度法的檢測結果較顯色基質法更為準確[4]。

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(1,3)-β-D-葡聚糖是真菌細胞壁的主要組分，鱟試劑中含有對其敏感的G-因子和會轉變并形成凝膠的凝固蛋白原。使用鱟試劑檢測(1,3)β-D-葡聚糖的試驗被稱為G-試驗，臨床上用于侵襲性真菌感染的早期診斷。

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二、替代檢測方法

鱟是珍稀動物，保護力度越來越大。因此，研發(fā)鱟試驗的替代方法成為當務之急。替代方法主要有蛋白染色法、熒光偏振法、同位素標記法和酶聯免疫測定法等。不過，這些替代方法的臨床應用價值仍待進一步研究或確認，目前臨床上應用最多的依然是鱟試驗法。

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參考文獻

[1]Su W, Ding X. Methods of endotoxin detection [J].J?Lab?Autom,2015,20(4): 354-364.

[2]Munford?RS.Endotoxemia-menace , marker, or mistake? [J].J Leukoc Biol, 2016,100(4):687-698.

[3]Gnauck A,Lentle RG, Kruger MC.Chasing a ghost?-Issues with the determination of circulating levels of?endotoxin in human blood [J].Crit Rev Clin Lab Sci, 2016,53(3): 197-215.

[4]Wong J,Davies N, Jeraj H, et al. A comparative study of?blood endotoxin detection in hacmodialysis?patients?[J/OL].J?Inflamm(Lond),2016,13:24[2018-10-06].doi:10.1 186/s12950-016-0132-5.

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免責聲明：

文章來源：上海醫(yī)藥 2018年?第39卷?第21期?（11月上），本文節(jié)選自：《細菌內毒素檢測方法及其臨床應用》，文章作者：沈銀忠。如有侵權，請聯系刪除，謝謝！