2023年2月，浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院祝水金團隊在Molecular Plant雜志（IF=21.949）發(fā)表題為“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in ”的研究論文，該研究對色素腺體形態(tài)發(fā)生的生物學過程以及調(diào)控色素腺體性狀的分子機制進行了深入探索。趙天倫特聘副研究員和祝水金教授為該論文通訊作者，博士生孫悅和韓一飛為共同第一作者。

研究背景

棉花（. spp）是重要的經(jīng)濟作物，棉籽中含有豐富的油分及蛋白質(zhì)。色素腺體是棉屬特有的防御結(jié)構(gòu)，其主要內(nèi)含物棉酚在棉花病蟲害抗性中起重要作用，但因其對人類和反芻動物的毒性，限制了棉籽資源的利用。比克氏棉（）等澳洲野生棉種具有優(yōu)良的“子葉色素腺體延緩形成形狀”性狀，種子無色素腺體低棉酚，有利于充分利用棉籽資源；植株有色素腺體有棉酚，有助于保持植株對病蟲害的抗性，具有重要的育種價值。探究色素腺體形態(tài)發(fā)生的生物學過程及其潛在分子機制，對培育種子無色素腺體而植株有色素腺體的新型低酚栽培棉種至關(guān)重要。

研究內(nèi)容

本研究利用萌發(fā)48小時 子葉（色素腺體形態(tài)發(fā)生的活躍階段）作為樣本制備原生質(zhì)體，進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)。進而采用無監(jiān)督聚類將細胞分成14個類群，通過已知細胞marker基因分為8個細胞類型。聚類結(jié)果證實色素腺體細胞與其他細胞分離明顯，進一步通過細胞亞群分為色素腺體薄壁細胞、分泌細胞和凋亡細胞。結(jié)合單細胞表達圖譜信息，并整合色素腺體細胞發(fā)育軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、核心轉(zhuǎn)錄因子功能驗證，構(gòu)建出相對完整的色素腺體形態(tài)建成模型，并證實光和赤霉素可促進色素腺體的形成。此外，本文挖掘了3個影響色素腺體形成的基因和。這些發(fā)現(xiàn)揭示了棉花色素腺體形態(tài)發(fā)生生物學過程以及調(diào)控色素腺體性狀的分子機制。

研究路線

研究結(jié)果

1.棉花子葉單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建

生理發(fā)育試驗研究證實，比克氏棉休眠棉籽無色素腺體無棉酚，直到種子萌發(fā)12小時后才檢測到棉酚，并在萌發(fā)過程中逐漸在子葉中積累。因此為了利用scRNA-seq構(gòu)建完整的色素腺體發(fā)育軌跡，本研究選取萌發(fā)48小時的比克氏棉子葉樣本。采用scRNA-seq平臺對原生質(zhì)體細胞進行檢測，成功獲得12222個高質(zhì)量細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。進一步通過主成分分析(PCA)和無監(jiān)督聚類，分離14個不同的細胞類群。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中報道細胞類型marker鑒定，將14個不同的cluster分為8個細胞群，包括葉肉細胞(MC)、色素腺體細胞(PG)、表皮細胞(EC)、保衛(wèi)細胞(GC)、木質(zhì)部細胞(XC)、原形成層細胞(PC)、韌皮部薄壁細胞(PP)和伴細胞(CC)。

為了驗證新的細胞標記基因，本文通過RNA原位雜交確定了兩個新細胞標記基因： 和，進一步明確了色素腺體細胞類群定義的可靠性。此外，從bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中獲得的表達模式也支持scRNA-seq特異性色素腺體細胞的結(jié)論，功能分析證實較多富集通路與感興趣的細胞相關(guān)。

圖1 |?棉花子葉單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建

2.色素腺體細胞的發(fā)育軌跡

色素腺體細胞類型與其他細胞類型分離明顯，進一步將其分為三個細胞亞群，棉酚生物合成基因在亞型2中高度富集，表明亞型2為分泌細胞，亞型1被確定為色素腺體薄壁細胞，進一步對細胞亞型進行GO分析，證實核糖翻譯相關(guān)的功能在色素腺體薄壁細胞中富集，與萜類化合物生物合成相關(guān)在分泌細胞中富集。由于氧化還原酶活性的富集，線粒體和核糖體基因的低表達，推測亞型3是凋亡前細胞。bulk RNA-seq數(shù)據(jù)證實了細胞亞型的分配。

為了揭示參與色素腺體發(fā)育時空調(diào)控的基因，通過擬時序分析進行模塊劃分。模塊a涉及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，表明色素腺體細胞發(fā)育的激活可能依賴于外部刺激。模塊d顯示出萜類生物合成的特征，與成熟分泌細胞中的棉酚合成一致。模塊e涉及DNA構(gòu)象變化等，是凋亡細胞的典型特征。

圖2 |?色素腺體細胞的發(fā)育軌跡

3.參與色素腺體形成轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

與色素腺體分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在色素腺體細胞中被鑒定出來，包括和。從薄壁細胞到分泌細胞的轉(zhuǎn)變受和的調(diào)控，而從分泌細胞到凋亡細胞的轉(zhuǎn)變受的調(diào)控。為了尋找下游基因，對進行DNA親和純化測序(DAP-seq)，將DAP-seq和scRNA-seq進行整合，建立了一個以為樞紐基因的TF網(wǎng)絡(luò)，獲得棉花色素腺體形態(tài)建成的工作模型。

為了驗證該模型，進而對子葉采用bulk RNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達量在萌發(fā)過程中增加。采用病毒誘導基因沉默(VIGS)方法驗證8個代表性轉(zhuǎn)錄因子的功能，證實沉默的幼苗葉和莖中的色素腺體密度和棉酚含量均顯著低于陰性對照的幼苗。結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)錄因子可能在棉花色素腺體的形成中起重要作用。

圖3 | 棉花色素腺體形態(tài)建成模式圖

圖4 |?轉(zhuǎn)錄因子在色素腺體發(fā)育中的功能驗證

4.光和GA參與色素腺體的形成

此外，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組、bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)表型分析，結(jié)合核心轉(zhuǎn)錄因子的啟動子鑒定，發(fā)現(xiàn)了光和赤霉素影響棉花色素腺體形成，并通過暗、光、赤霉素(GA)和赤霉素抑制劑（多效唑）不同組合處理下的比克氏棉色素腺體的發(fā)育情況進行驗證。在種子吸收36、48、60、84 h，光照+GA條件的色素腺體密度大于光照條件，顯著大于暗+GA條件的色素腺體密度。結(jié)果表明，光和GA能夠促進色素腺體的形成。進一步比較暗處理和光處理下色素腺體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，在無光條件下表達水平下調(diào)。此外，在黑暗條件下，大多數(shù)棉酚生物合成基因的表達水平上調(diào)，這表明光可能抑制棉酚的合成。

圖5 |?光和GA促進色素腺體發(fā)育

研究結(jié)論

本文描繪了首個棉花子葉單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜，利用比克氏棉色素腺體的獨特性狀和scRNA-seq技術(shù)揭示了色素腺體的發(fā)育軌跡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)3個影響色素腺體形成的新基因和。這些發(fā)現(xiàn)為色素腺體的形態(tài)發(fā)生提供新見解，并為未來的棉花scRNA-seq研究奠定基礎(chǔ)。

推薦語

本文探索了棉花色素腺體發(fā)育的生物學過程以及調(diào)控形態(tài)發(fā)生性狀的分子機制，首先構(gòu)建棉花子葉單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，其次利用色素腺體細胞發(fā)育軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、核心轉(zhuǎn)錄因子功能驗證等方法，揭示了一個相對完整的色素腺體形態(tài)建成模型。這篇文章系統(tǒng)闡述了棉花色素腺體形態(tài)和生物學過程的重要作用機制，并突出單細胞RNA測序及其擬時序分析的研究價值，十分值得借鑒。

Sun Y, Han YF, Sheng K,.?Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in[J]. , 2023.