本期與您分享的是：鈣循環(huán)素結(jié)合蛋白促進(jìn)果糖激酶2降解調(diào)節(jié)蘋果內(nèi)糖穩(wěn)態(tài)。

果糖激酶（FRK）通過磷酸化激活果糖，使激活的果糖進(jìn)入初級代謝，調(diào)節(jié)植物的果糖信號傳導(dǎo)能力。蘋果（Malus×domestica） FRK基因MdFRK2表現(xiàn)出特別高的果糖親和力，其過表達(dá)會降低幼嫩植株葉片中的果糖水平。然而，在目前對成熟植物的研究中，過度表達(dá)MdFRK2的轉(zhuǎn)基因蘋果樹的果實(shí)比野生型（WT）果實(shí)積累了更高水平的果糖（在年輕和成熟階段）。與WT相比，MdFRK2 mRNA高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蘋果樹在成熟葉、幼果和成熟果中MdFRK2蛋白豐度和FRK酶活性均無顯著差異。

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免疫沉淀-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)skp1、cullin、F-box（SCF）E3泛素連接酶、鈣循環(huán)素結(jié)合蛋白（CacyBP）與MdFRK2相互作用。RNA測序分析為泛素介導(dǎo)的MdFRK2蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在成熟葉片和果實(shí)中維持果糖穩(wěn)態(tài)提供了證據(jù)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MdCacyBP-MdFRK2調(diào)控模塊，MdCacyBP與MdFRK2相互作用并泛素化MdFRK2，促進(jìn)其被26S蛋白酶體降解，從而降低FRK酶活性，從而提高轉(zhuǎn)基因蘋果樹的果糖濃度。這一結(jié)果揭示了通過泛素化和降解調(diào)節(jié)MdFRK2蛋白水平來實(shí)現(xiàn)植物果糖在不同器官內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。我們的研究為未來改進(jìn)蘋果風(fēng)味提供了有用的數(shù)據(jù)，并擴(kuò)展了我們對植物果糖含量和信號調(diào)控的分子機(jī)制的理解。

MG132（Abmole，M1902，純度>98%）（ https://www.abmole.cn/products/mg132. html）是一種蛋白酶體抑制劑，IC50為100 nM，也抑制鈣蛋白酶，IC50為1.2 μM。MG132可以抑制NLRP1的活化。

DMSO（Abmole，M3850，純度>99%）（https://www.abmole.cn/products/dimethyl-sulfoxide.html）二甲基亞砜（簡稱DMSO）能溶于水、乙醇、丙醇、乙醚、苯和氯仿等大多數(shù)有機(jī)物，被譽(yù)為“萬能溶劑”，是常用的有機(jī)溶劑中，溶解能力最強(qiáng)的一種。

CacyBP同源物與siah相互作用蛋白（SIP）形成E3泛素連接酶復(fù)合物，然后以蛋白質(zhì)為目標(biāo)進(jìn)行泛素化。這促使我們研究MdCacyBP是否可以使用體內(nèi)泛素化試驗(yàn)來泛素化MdFRK2。在本草葉片中共表達(dá)MdCacyBP-Flag和MdFRK2- GFP，并分析MdFRK2的泛素化水平。MdFRK2-GFP蛋白的泛素化形式分別用抗Ubi和抗GFP抗體檢測。當(dāng)用抗泛素抗體檢測時，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量較高的MdFRK2顯著增加（圖4A和B），說明MdFRK2的泛素化是由MdCacyBP介導(dǎo)的。由于泛素化修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)入26S蛋白酶體進(jìn)行降解，因此有理由懷疑MdCacyBP對MdFRK2的降解依賴于26S蛋白酶體途徑。

為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了無細(xì)胞降解試驗(yàn)。從WT和MdFRK2-OE蘋果葉片中提取的總蛋白與純化的MdCacyBP-His在MG132或其溶劑二甲基亞砜（DMSO）存在下孵育。在指定的時間點(diǎn)，用抗mdfrk2抗體對蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡分析。如圖4C和D所示，MdFRK2- OE提取物中MdFRK2蛋白的降解速度比WT提取物快，說明MdCacyBP加速了MdFRK2蛋白的降解。同時，蛋白酶體抑制劑MG132的應(yīng)用抑制了MdFRK2蛋白的降解，這表明MdFRK2的降解可能是由26S蛋白酶體介導(dǎo)的。

MdCacyBP泛素化MdFRK2的能力是通過體內(nèi)泛素化試驗(yàn)證實(shí)的，蛋白酶體抑制劑處理（MG132）進(jìn)一步驗(yàn)證MdFRK2降解是否由26S蛋白酶體途徑介導(dǎo)（圖5A）。在兩個OE系中，MdFRK2蛋白豐度因MG132處理而增加，但不受DMSO影響（圖5B）。相比之下，在WT中，MdFRK2蛋白水平與任何一種處理相似。

這些發(fā)現(xiàn)證明MdFRK2蛋白通過26S蛋白酶體的方式降解。與MdFRK2蛋白豐度的增加相一致，當(dāng)MG132處理時，轉(zhuǎn)基因系中的FRK活性顯著增加，約41%至68%（圖5C）。與之形成鮮明對比的是，MG132處理后，相對果糖濃度顯著低于WT（圖5D）。考慮到這些分析，MdFRK2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)可能通過調(diào)節(jié)FRK活性來維持果糖穩(wěn)態(tài)。

鳴謝：Jing Su, et al. Plant Physiol. 2023 Feb 12;191(2):1052-1065.