大腦計算和信息存儲與人類約860億神經元的突觸網絡結構密切相關。為了探索這種擁擠而復雜的組織的結構、連接和功能活動是如何隨著時間的推移而演變的，理想的方法是使用一種能夠對活體腦組織進行成像和計算機重建的技術。

將活體腦組織三維重建到單個突觸水平，將為解碼大腦復雜而密集的信息處理網絡的動力學和結構-功能關系創(chuàng)造機會；然而，這受到了光學成像3D分辨率不足、信噪比不足和光負擔過高的阻礙。電子顯微鏡（EM）重建通過追蹤所有神經元結構并以單個突觸的準確性確定連接，從而解碼“連接體”，為大腦結構提供了最詳細的見解；然而，這僅限于靜態(tài)表示，而特定的分子標記需要相關的方法?；诠鈱W顯微鏡的組織重建技術將能夠觀察生命系統中的結構動力學。復雜的腦組織需要3D超分辨率方法，因為重建受到最低分辨率方向（通常沿光軸；z方向）的限制。常規(guī)（衍射限制）顯微鏡無法實現，其最佳橫向分辨率約為所用光波長的一半，軸向分辨率低至約1000?nm用于組織相容物鏡和遠紅色激發(fā)。

本文介紹了在單個突觸水平上對活體腦組織的密集重建。該技術在納米級分辨率的3D重建中解鎖形態(tài)動力學，同時訪問分子和功能信息。該研究開發(fā)了一種集成的光學/機器學習技術，打破了實時超分辨率成像中3D分辨率、信噪比、速度和光負荷的相互制約。該技術基于受激發(fā)射損耗（stimulated emission depletion, STED）顯微鏡。該研究組修改了STED，以提高SNR和各向同性超分辨率組織成像，并結合兩階段深度學習策略。

該研究使用野生型C57BL/6J小鼠，試驗流程包括：器官海馬切片、ECS標記、整體海馬的急性制備及標記、大腦類器官產生、LIONESS成像、重復體積實時成像、PSD95 HaloTag標記、病毒載體組裝和突觸素標記、髓鞘標記、鈣顯像及化學遺傳學激活、電生理學分析；SulfoAtto 643的合成與表征、重構網絡訓練、去噪、顯像圖像處理、體積圖像擴展、軸突示蹤、手動分割和校對、自動分割、可視化、樹突提取、手動分段和校對、區(qū)分重構不準確和生物移動、PSD95相對于神經元結構的定位、統計和再現性。

第一階段利用了來自大量單獨的先前測量的樣本結構信息，在不犧牲分辨率的情況下減少了光負荷和成像時間，從而實現了活組織兼容的體積超分辨率成像。

第二階段改編自EM連接組學，將體積實時成像數據轉化為納米級解析的實例分割。這項技術稱為實時信息優(yōu)化納米拷貝、實現飽和分割（live information-optimized nanoscopy enabling saturated segmentation，LIONESS）。LIONESS將實時成像與無偏見的納米級重建相結合，通過形態(tài)學動力學、分子身份和神經元活動信息擴展組織分析。

圖1.LIONESS能夠實現活體腦組織的密集重建

圖2.分割驗證

然后將LIONESS應用于DG中的活體海馬神經膠質，以無限制地可視化該復雜區(qū)域的結構。重建了不同的細胞成分，包括有髓和無髓軸突、棘樹突和神經膠質細胞。與EM類似，自動分割的校對仍然是一個時間限制因素，因此通常更傾向于選擇性地將其應用于感興趣的結構。確定了29個軸突，其中一個突起直接接觸脊椎頭部，產生了39個潛在的突觸。大多數軸突形成單或雙連接；然而，也觀察到三重和四重接觸。長度和密度的量化都與以前的數據保持一致。

圖3.活體海馬的連接重建

分子信息重建

接下來，將活分子標記的關鍵方法集成到組織重建中。親和標記證實了特定結構的身份，如有髓軸突。值得注意的是，光學顯微鏡在觀察特定蛋白質方面是無與倫比的。使用與內源性PSD95蛋白融合的HaloTag的敲除表達，可視化所有興奮性突觸后末梢。該研究確定了16個軸突與重建的樹突伸展進行分子驗證的突觸接觸，形成了18個連接，同時否決了一個形態(tài)學提示但PSD95缺失的連接。興奮性突觸優(yōu)先位于樹突棘，但也可以發(fā)生在軸上，尤其是在棘突中間神經元上。該研究使用組合的分子/結構信息來確定具有軸位置的興奮性突觸的比例，與突觸分子的共焦讀出的比較進一步說明了LIONESS增強的3D定義。

圖4 活體腦組織的分子信息重建

形態(tài)動力學和活性

首先對相同的海馬神經膠質體積進行了3d LIONESS重復成像。測試了圖像恢復和分割不準確性在多大程度上限制了形態(tài)動力學的檢測，作為對照。比較了配對測量中相同樹突棘的手動分割，其中生物運動在同時重復測量中被排除，或者在10分鐘的測量間隔期間可能發(fā)生結構變化。同樣，雖然恢復的3D數據和手動分割的不確定性主要存在于體素水平，但軸突形狀的更明顯變化很容易檢測到。

設計了一種全光方法來關聯活體細胞網絡中的3D結構和信號。重點研究了海馬回路。接下來，開發(fā)了一種更精細的方法來研究活性和動力學，將化學遺傳學靶向細胞活化與Ca2+成像和同一活體標本的動態(tài)重建相結合。在DG顆粒細胞中稀疏表達了病毒編碼的DREADD（由設計藥物獨家激活的設計受體）43hM3Dq，在應用生物正交藥物氯氮平-N-氧化物（CNO）時增強了神經元興奮。與轉基因GCaMP6f的表達一起，這允許控制DG門中大型苔蘚纖維的活性并對其進行成像，然后用LIONESS將其與突觸后門苔蘚細胞的復雜棘重建在一起。對相鄰苔蘚纖維叢的可視化進一步闡明了空間關系。然而，由于其對活體組織的適用性，LIONESS有能力直接在活體狀態(tài)下重復檢索活動和動態(tài)結構信息，并有可能遵循結構可塑性并確定結構-功能關系。

圖5 海馬苔蘚纖維-肝門苔蘚細胞突觸的三維形態(tài)動力學和化學遺傳學誘導的Ca2+活性

電生理學

使用LIONESS，光學顯微鏡不僅可以用于指導電生理實驗，還可以將單個和突觸連接神經元的電特性與生存狀態(tài)下潛在的神經元結構聯系起來。只有用LIONESS進行的全面的3D超分辨描繪揭示了在共聚焦模式下遺漏的一個干預的、未標記的神經元過程。這證實了LIONESS適合于在活體標本中多模式檢索和關聯組織結構的結構和功能方面，并且在這方面比衍射限制成像更強大。

為了擴展分析量并嵌入中尺度背景，遵循了兩種直接的策略

首先，記錄多個部分重疊的體積可以對它們進行3D配準，從而使分割平滑地擴展到邊界。從四個連續(xù)的成像體積中重建了急性制備的小泡中70μm長的大部分平行軸突纖維，捕獲了約3?mm累積軸突長度。

其次，以共焦分辨率將LIONESS嵌入到更大的體積中。成像650000?DG嵴中的μm3體積提供了位置背景，并允許識別更大的物體，如細胞體細胞和主要樹突分支，而LIONESS顯示了DG顆粒細胞的軸突和嵌入神經膠質細胞內陷的其他軸突。因此，跨空間尺度的成像產生了關于細胞位置和身份的信息，擴展了LIONESS對形態(tài)動力學和連通性分析的解釋。

該研究組開發(fā)了一種重建活腦組織及其時間進化的技術，結合分子信息和活動的操縱和讀出，從而彌合了高準確但靜態(tài)的EM表示與光顯微鏡重建陽性標記、不完整的細胞亞群之間的差距。總之，LIONESS開啟了對活哺乳動物大腦和其他器官中復雜、動態(tài)組織結構的解碼，并可能最終挑戰(zhàn)我們對中樞神經系統可塑性的程度和意義的思考方式。

該研究開發(fā)了集成的光學/機器學習技術LIONESS（實時信息優(yōu)化納米拷貝，實現飽和分割）。通過機器學習，利用對全面、細胞外標記組織中的受激發(fā)射耗盡顯微鏡的光學修改和先前關于樣本結構的信息，同時實現各向同性超分辨率、高信噪比和與活體組織的兼容性。這允許在突觸水平上進行密集的基于深度學習的實例分割和3D重建，結合分子、活動和形態(tài)動力學信息。LIONESS為研究活體腦組織的動態(tài)功能（納米）結構開辟了途徑。

原文出處

Velicky, P., Miguel, E., Michalska, J.M. et al. Dense 4D nanoscale reconstruction of living brain tissue. Nat Methods (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01936-6

編譯作者：VONVEY（brainnews創(chuàng)作團隊）

校審：Simon（brainnews編輯部）