寫在前面

????????今天推薦的是由加州大學(xué)舊金山分校生物化學(xué)和生物物理學(xué)系在2019年6月13日發(fā)表于Journal of Cell Biology（2021IF：10.539，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Jeremy F. Reiter教授，研究表明SFI1通過招募USP9X來穩(wěn)定小頭畸形蛋白STIL進(jìn)而促進(jìn)中心粒復(fù)制。

研究背景

????????在哺乳動物細(xì)胞中，中心體是微管組織中心，參與細(xì)胞過程，如纖毛發(fā)生和細(xì)胞分裂。MCPH 突變會改變中心體組織并減弱中心粒重復(fù)。影響中心粒復(fù)制的人類突變會導(dǎo)致小頭畸形。

摘要部分

????????作者確定了酵母SFI1的哺乳動物同源物的作用，參與酵母紡錘體極體的復(fù)制，作為哺乳動物細(xì)胞中中心粒復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。哺乳動物SFI1與USP9X相互作用，USP9X是一種與人類綜合征性智力低下相關(guān)的去泛素化酶。STIL是中心粒復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SFI1在 S 期將USP9X定位到中心體以去泛素化STIL。USP9X介導(dǎo)的去泛素化可保護(hù)STIL免于降解。與USP9X在穩(wěn)定STIL中的作用一致，來自USP9X功能喪失突變患者的細(xì)胞STIL水平降低了。總之，這些結(jié)果表明SFI1是一種中心體蛋白，可將USP9X定位到中心體以穩(wěn)定STIL并促進(jìn)中心粒復(fù)制。作者認(rèn)為USP9X對STIL的保護(hù)以促進(jìn)中心粒復(fù)制是這兩種蛋白質(zhì)在人類神經(jīng)發(fā)育中的作用的基礎(chǔ)。

研究內(nèi)容

1.SFI1在S期聚集在中心體??? ?

????????在釀酒酵母中，SFI1是紡錘體極體復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其功能相當(dāng)于中心體。為了評估SFI1的人類同源物是否與中心體相關(guān)，作者生成了人類SFI1的抗體，并為SFI1和中心蛋白2共染色了 HeLa 細(xì)胞。人SFI1不存在于有絲分裂紡錘體兩極，但位于間期中心體周圍，在S期達(dá)到峰值。為了進(jìn)一步測試SFI1的中心體富集，作者從 HeLa 細(xì)胞中分離了中心體，發(fā)現(xiàn)SFI1與中心體成分 γ-微管蛋白共同分離。使用GFP標(biāo)記的SFI1，作者評估了轉(zhuǎn)染后S期的定位。GFP-SFI1定位于間期中心體。有趣的是，在GFP-SFI1轉(zhuǎn)染后12小時，細(xì)胞表現(xiàn)出與成熟中心粒蛋白 CP110的共定位，表明SFI1表達(dá)的增加可能促進(jìn)中心粒復(fù)制。

????????作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SFI1在 HeLa 和 U2OS 細(xì)胞中與外圍成分CEP131部分共定位。為了確認(rèn)SFI1定位于中心體外圍，作者探究了SFI1在 PCM1（PCM1 是中心衛(wèi)星的重要組成部分，對于中心衛(wèi)星的完整性至關(guān)重要）敲除或敲低細(xì)胞中的定位。在沒有中心體衛(wèi)星的情況下，SFI1在中心體積累，類似于其他衛(wèi)星蛋白。由于中心粒復(fù)制需要中心粒及其周圍成分，作者探究了兩者在SFI1敲除細(xì)胞中的組織。敲除SFI1的 HeLa 細(xì)胞顯示CEP135的中心體定位增加，CEP135 是中心粒組裝和穩(wěn)定性所需的 MCPH 相關(guān)蛋白。免疫印跡分析顯示，SFI1敲低導(dǎo)致 CP110 水平降低，但不會導(dǎo)致CEP135水平降低，進(jìn)一步表明SFI1參與了中心體周圍基質(zhì)的組織。

研究結(jié)論：SFI1在S期聚集在中心體。

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2.中心粒復(fù)制需要SFI1? ???

????????為了確定SFI1對于中心粒的復(fù)制是否必須，作者研究了SFI1的敲低是否會廢除中心粒的復(fù)制。與以前的研究一致，siRNA介導(dǎo)的SFI1的敲低減少了中心粒的數(shù)量。作者通過連續(xù)切片電鏡探究了S期對照和SFI1 siRNA處理的細(xì)胞中的中心粒。對照組細(xì)胞形成了與先前存在的中心粒相關(guān)的原中心粒，而SFI1缺失的細(xì)胞未能復(fù)制其中心粒。因此，人SFI1是中心粒復(fù)制所必需的。? ? ?

????????作者接下來探究中心粒復(fù)制的早期啟動因子SAS6和STIL的定位。研究發(fā)現(xiàn)，SFI1敲低的細(xì)胞不能招募SAS6和STIL到S期中心體。免疫印跡分析顯示，SFI1的敲低并不明顯影響SAS6的水平，但卻大大降低了STIL的水平，這表明在SFI1敲低的細(xì)胞中，中心粒復(fù)制的失敗可能是由于STIL的不穩(wěn)定造成的。

????????通過免疫印跡分析，作者發(fā)現(xiàn)SFI1的敲低破壞了全長STIL和STIL的MD3結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，表明SFI1通過aa 715-988穩(wěn)定STIL。由于SFI1定位并穩(wěn)定中心體CP110，而CP110與中心粒復(fù)制有關(guān)，作者研究了恢復(fù)CP110的穩(wěn)定性是否可以回補(bǔ)SFI1敲低的細(xì)胞中的中心粒復(fù)制。為了恢復(fù) CP110 的穩(wěn)定性，作者敲低了 NEURL4，一種靶向 CP110 進(jìn)行降解的中心體泛素連接酶。免疫印跡分析顯示，NEURL4的敲低恢復(fù)了SFI1敲除細(xì)胞中的CP110水平。

研究結(jié)論：FI1的敲低破壞了STIL的穩(wěn)定性。

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3.SFI1與USP9X相互作用并將其招募到中心體? ? ?

????????作者通過中心體蛋白的鄰近相互作用物數(shù)據(jù)庫檢測到STIL相互作用物，確定了幾種 DUB可能發(fā)生相互作用，包括USP9X和USP14。作者使用內(nèi)源性STIL的免疫沉淀表明STIL與USP9X和USP14共沉淀。為了驗(yàn)證USP9X是否控制STIL功能，作者測試了它是否與STIL類似，參與了中心粒復(fù)制。USP9X的敲低減弱了中心粒重復(fù)、STIL的表型復(fù)制消耗，同時降低了STIL的中心體定位和蛋白質(zhì)水平。為了進(jìn)一步評估USP9X是否影響STIL水平，作者表達(dá)了HA-USP9X或酶促失活的 HA-USP9XC1566A。HA-USP9X的表達(dá)升高會增加STIL水平，而HA-USP9XC1566A則不會。由于USP9X是一種去泛素化酶，作者隨后檢查了表達(dá) HA-USP9X的細(xì)胞中STIL的穩(wěn)定性是否與STIL泛素化降低有關(guān)。HA-USP9X的表達(dá)減少了K48連接的泛素化STIL。

????????為了確認(rèn)USP9X定位于中心體，作者用Centrin對 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行染色以標(biāo)記中心粒和USP9X。與SFI1一樣，USP9X在S期定位于中心體。USP9X水平在G1和S階段僅略高，表明其中心體定位不是由于其他階段的選擇性降解。另一方面，SFI1的敲低也阻止了USP9X在中心體上的積累。敲低USP9X并不影響SFI1的中心體定位或穩(wěn)定性，表明SFI1是USP9X中心體定位所必需的，反之亦然。

研究結(jié)論：USP9X促進(jìn)了STIL水平，USP9X與其相互作用因子SFI1一樣，對于S期中心體的STIL積累至關(guān)重要，SFI1對USP9X定位到中心體是必不可少的，并穩(wěn)定STIL以促進(jìn)中心粒的復(fù)制。

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4.USP9X直接去泛素化STIL? ??

????????作者接下來USP9X的藥理學(xué)抑制是否會降低STIL穩(wěn)定性。作者用 WP1130處理 HeLa 細(xì)胞，WP1130（Degrasyn）是USP9X的選擇性抑制劑。STIL水平被WP1130明顯降低。由于中心粒復(fù)制需要STIL，作者檢查了WP1130是否也影響中心粒數(shù)。STIL和 Centrin的免疫熒光染色顯示W(wǎng)P1130減少了STIL在中心體的定位，并減少了中心粒數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)表明WP1130破壞了中心體組織。USP9X與STIL相鄰。相互免疫沉淀證實(shí)，USP9X和STIL相互作用。為了確定STIL的哪個結(jié)構(gòu)域結(jié)合USP9X，作者通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)STIL的MD3片段與USP9X相互作用。為了測試MD3片段是否影響STIL穩(wěn)定性，作者克隆了表達(dá)全長Myc標(biāo)記的STIL和缺乏MD3結(jié)構(gòu)域 (STILΔMD3) 的STIL的構(gòu)建體。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)STILΔMD3的穩(wěn)定性明顯低于全長STIL。除了穩(wěn)定性較差之外，STILΔMD3不結(jié)合USP9X。因此，USP9X通過其MD3域結(jié)合并穩(wěn)定STIL。作者接下來研究了MD3是否被K48多泛素化。研究發(fā)現(xiàn)MD3域被K48多泛素化，這表面USP9X可能通過與其MD3域相互作用和去泛素化來穩(wěn)定STIL。另一方面，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP9X的催化結(jié)構(gòu)能特異性地使全長的STIL及其MD3結(jié)構(gòu)域去泛素化。

研究結(jié)論：USP9X通過去泛素化其MD3域來穩(wěn)定STIL，并且STIL穩(wěn)定性對于中心粒復(fù)制至關(guān)重要。

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5.神經(jīng)發(fā)育USP9X突變使STIL不穩(wěn)定? ? ?

????????最近的一項(xiàng)研究確定了MRXS99F女性的USP9X功能喪失突變。MRXS99F患者表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、顱面異常和先天性腦畸形。為了測試與MRXS99F相關(guān)的功能喪失突變是否影響USP9X定位，作者檢查了USP9X在MRXS99F患者成纖維細(xì)胞中的定位。有趣的是，與對照相比，所有患者細(xì)胞系中USP9X的中心體積累都有所減少。同時，SFI1的定位在MRXS99F成纖維細(xì)胞中沒有受到影響。與作者發(fā)現(xiàn)的USP9X穩(wěn)定STIL相一致，MRXS99F相關(guān)的USP9X突變減少了中心體STIL。檢查MRXS99F成纖維細(xì)胞的中心體組織，發(fā)現(xiàn)CP110減少，CEP135增加。鑒于MRXS99F成纖維細(xì)胞中中心體STIL的減少，作者評估了患者來源的成纖維細(xì)胞中的中心體數(shù)量。所有測試的四個MRXS99F成纖維細(xì)胞系都顯示出中心粒的數(shù)量減少，這就提出了MRXS99F相關(guān)的智力障礙和大腦畸形是由于神經(jīng)發(fā)生過程中中心粒復(fù)制的缺陷而產(chǎn)生的可能性。

????????由于USP9X也控制STIL的穩(wěn)定性，而STIL促進(jìn)中心粒的復(fù)制，作者研究了MRXS99F成纖維細(xì)胞中中心粒的數(shù)量減少是否與STIL的不穩(wěn)定有關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)所有四個MRXS99F成纖維細(xì)胞系都顯示出STIL水平的降低。與SFI1在USP9X上游的功能一致，SFI1的蛋白水平?jīng)]有改變。作者提出，MRXS99F可能至少是由STIL穩(wěn)定性下降和中心粒復(fù)制的伴隨性缺陷引起的。

研究結(jié)論：哺乳動物SFI1是一種中心體蛋白，它控制去泛素化酶USP9X的定位以穩(wěn)定STIL，從而積極地調(diào)節(jié)中心粒的復(fù)制，USP9X介導(dǎo)的對STIL水平和中心粒復(fù)制的控制對于人類大腦發(fā)育至關(guān)重要。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者發(fā)現(xiàn)人類SFI1在S期定位于中心體并招募USP9X，在那里它們起到穩(wěn)定原中心粒因子STIL的作用，最終促進(jìn)中心粒復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)為中心粒復(fù)制的時間如何被調(diào)控，以及損害大腦發(fā)育的人類突變?nèi)绾纹茐闹行牧５纳锇l(fā)生提供了機(jī)制上的見解。

Thank you!

原文鏈接：https://doi.org/10.1083/jcb.201803041