· 原理 ·

巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應答、免疫調節(jié)等生物學功能。腹腔巨噬細胞多游離存在于腹水中易于獲得。因此，可以通過向小鼠腹腔內注射刺激物制造無菌炎癥環(huán)境以積聚巨噬細胞，來進行巨噬細胞研究。以下為具體實驗方案。

· 檢測步驟 ·01材料

昆明小鼠，SPF級，體質量18～22 g，雄性，6～8周齡。

02肉湯制備

• 6%淀粉肉湯制備?

將1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化鈉放入盛有100 mL雙蒸水的燒杯中，置于磁力攪拌器常溫溶解后121℃滅菌30min，于4℃保存。

• 3%巰基乙酸鹽肉湯的制備

1L雙蒸水中加入29g巰基乙酸鹽，煮沸使其完全溶解，玻璃瓶或離心管分裝后121℃滅菌15min，4℃保存，使用前確保已經冷卻。

03巨噬細胞的誘導

每次腹腔注射3%巰基乙酸鹽肉湯1mL，每天1次，3d后用預冷PBS灌洗腹腔2次。

04巨噬細胞的收集

準備75%乙醇，以脫頸方式處死小鼠，浸泡3min。取出，置于無菌操作臺，仰臥位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部將針頭刺入皮下進入腹腔，將5mL預冷的PBS(培養(yǎng)液組為5mL預冷的10%血清ＲPMI 1640培養(yǎng)液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。無菌條件下剪開小鼠腹部皮膚顯露胸腹部，用無菌止血鉗提起劍突處組織，無菌剪刀在該處剪開約1mm2小口。注意止血鉗保持提起狀態(tài)，用無菌巴氏吸管從腹腔開口深入腹腔，反復沖洗腹膜腔灌洗液2次，可回收約8mL 淡黃色灌洗液。

05巨噬細胞的純化與培養(yǎng)

將每只小鼠的灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心10min，所得細胞沉淀用ＲPMI 1640培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)體系于37℃靜置培養(yǎng)2～3h后洗去未貼壁細胞，余下的貼壁細胞即為巨噬細胞。

06巨噬細胞形態(tài)學觀察及計數(shù)

細胞貼壁培養(yǎng)24h后在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。用0.5%胰酶消化細胞，離心棄上清液，PBS重懸得到細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)每只小鼠腹腔中分離的巨噬細胞數(shù)量。

07臺盼藍染色檢測巨噬細胞活性

將500μL“1.6中”的各組巨噬細胞懸液和500μL臺盼藍染液(0.4%濃度) 加入3.5cm培養(yǎng)皿，搖勻后靜置3～8min; 吸取1滴混合液滴入載玻片，3min內鏡下計數(shù)巨噬細胞200個，分別統(tǒng)計活/死細胞數(shù)目(死細胞呈藍色，活細胞無色透亮) ; 細胞活性(%) = 活細胞數(shù)/200×100%。每組檢測重復3次。

· 注意事項 ·

小鼠腹腔注射刺激物時不要刺破內臟，可以在操作過程中將小鼠頭部向下抓取，使其腹部內容物滑向膈下以避開注射器針頭; 若回收的小鼠腹腔灌洗液過少，可另外注入預冷的PBS重復灌洗；若不小心致腹腔出血，可在腹腔液離心后重懸時加入5倍細胞懸液體積的紅細胞裂解液，再次離心棄上層紅色液體。