這篇文章由中國科學院生物物理研究所的王立堃團隊完成

Li等人發(fā)現(xiàn)VMP1是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的調(diào)節(jié)因子。在vmp1缺失的細胞中，UPR的三個分支通過鈣干擾和ER-線粒體相互作用受到差異調(diào)節(jié)。結(jié)果，VMP1缺乏盡管損害細胞生長，但是可以保護細胞免受慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，

Highlights

1.三個UPR分支在VMP1缺陷細胞中受到差異調(diào)節(jié)
2.鈣直接激活vmp1缺失細胞中的PERK，而不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
3.線粒體應(yīng)激和PERK啟動ISR，使VMP1-KO細胞中的IRE1a和ATF6抑制

4.盡管對細胞生長不利，但VMP1缺乏賦予慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抗性

背景：

ER作為細胞內(nèi)重要細胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊、翻譯后修飾等細胞內(nèi)重要生理過程。蛋白質(zhì)的正確折疊對于蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮起關(guān)鍵作用。在ER中，存在各種調(diào)控機制，以確保蛋白質(zhì)的正確折疊、修飾、組裝以及正常運輸[3]

但當缺乏營養(yǎng)物質(zhì)、鈣穩(wěn)態(tài)不平衡、過度表達分泌蛋白、以及缺氧等狀態(tài)時會造成不能正確折疊或成功分泌的蛋白質(zhì)可能會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中積聚，未折疊蛋白或錯誤折疊在ER內(nèi)大量積累，從而引起ERS。細胞發(fā)生ERS時，細胞為了挽救這種病理狀態(tài)，會激活一系列互補的適應(yīng)性機制來減少這種錯誤折疊或未折疊蛋白的積聚，恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，這些機制被稱為UPR

迄今為止，一共發(fā)現(xiàn)了三種UPR途徑，即IRE1a、PERK和ATF6途徑。在正常情況下，伴侶蛋白GRP78/BiP像一個帽子緊緊地扣在ER上的跨膜蛋白上，而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時GRP78/BiP與跨膜蛋白解離，而去結(jié)合未折疊或錯誤折疊蛋白，跨膜蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器/跨膜蛋白（IRE1α、Perk、ATF6）被激活? →進一步引發(fā)upr下游信號通路。

UPR信號廣泛參與炎癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等疾病，然而目前對UPR的機制仍然沒有完全闡明。

?一些：

Proteins that fail to fold correctly or secrete successfully may accumulate in the ER lumen to cause ‘‘ER stress,’’ under which the unfolded protein response (UPR) is initiated.

?IRE1a, PERK, and ATF6. These three proteins sense ER stress and activate multiple down-

stream signals to maintain ER homeostasis

“UPR的輸出可能是細胞保護或破壞。對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的不適當反應(yīng)可能導(dǎo)致疾病，其中細胞要么劫持UPR以適應(yīng)惡劣環(huán)境，要么失去生理功能并發(fā)生凋亡”

The existence of mitochondria-ER contacts (MERCs) and entanglement（相互作用）between ER stress and mitochondrial stress suggest that homeostasis of the ER and mitochondria are closelyrelated, but whether and how ER stress and mitochondrial stress affect each other remains unclear.

結(jié)果：

R1

為了揭示UPR的調(diào)控機制，，作者構(gòu)建了穩(wěn)定表達IRE1a和PERK熒光報告基因的293T細胞，根據(jù)UniProt網(wǎng)站，作者挑選了54個ER跨膜蛋白，并使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除相應(yīng)基因，進行了篩選，

VMP1敲除可以有力地誘導(dǎo)PERK活性，且對IRE1a信號沒有影響，然而在Tm誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，VMP1敲除抑制了IRE1a信號。

在敲除VMP1的情況下，沒有外部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時會誘導(dǎo)UPR中的PERK通路，而Tm誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時卻抑制UPR的另一條通路IRE1a通路，這似乎是矛盾的。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白(TMEMs，根據(jù)UniProt (https:// www.uniprot.org/)，作者選擇了54個已知或預(yù)測為er定位跨膜蛋白的TMEMs，并在表達UPR報告基因的細胞中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)27敲除每個TMEMs的基因，進行了一個小型篩選。

于是作者為了進一步驗證VMP1的作用，構(gòu)建了單純VMP1敲除細胞系，并測量了所有三種已知UPR途徑的標記物

VMP1 KO沒有引發(fā)IRE1a的XBP1 mRNA剪接或磷酸化，IRE1a是IRE1a激活的兩個標志物，也沒有誘導(dǎo)ATF6的切割和核轉(zhuǎn)位或ER管腔定位伴侶BiP的表達，即ATF6激活的標志物

然而，VMP1 KO導(dǎo)致PERK磷酸化（被認為是向更高分子量的帶轉(zhuǎn)移）、eIF2a磷酸化、ATF4表達和CHOP mRNA誘導(dǎo)，這些是即使沒有ER應(yīng)激處理也能激活PERK的經(jīng)典標志物。

令人驚訝的是，當細胞受到Tm的攻擊時，VMP1 KO抑制了IRE1a和ATF6的活性（圖1C–1E）。值得注意的是，VMP1在VMP1 KO細胞中的再表達在沒有Tm的情況下降低了PERK的活性，并在Tm的存在下恢復(fù)了IRE1a和ATF6的活性（圖1C和1D），排除了VMP1 KO細胞中UPR改變是由脫靶效應(yīng)引起的可能性。

在沒有外部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下誘導(dǎo)PERK通路和通過刪除VMP1來抑制tm誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1a通路似乎不尋常和矛盾。

于是作者在293T中構(gòu)建了不表達UPR報告者的VMP1敲除(KO)細胞系，并測量了所有三種已知UPR通路的標記，無論是否有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑

有趣的是，VMP1 KO沒有引起XBP1 mRNA剪接或IRE1a的磷酸化(IRE1a激活的兩個標記)，也沒有誘導(dǎo)ATF6的切割和核易位或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔定位伴侶BiP的表達，這是ATF6激活的標志，然而，VMP1 KO導(dǎo)致PERK磷酸化(被認為是向更高分子量的條帶移位)、eIF2a磷酸化、ATF4表達和CHOP mRNA誘導(dǎo)，這些都是即使沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激處理也能激活PERK的典型標記

VMP1 KO對三條UPR通路的不同影響（即PERK在基礎(chǔ)水平的特異性激活和IRE1a和ATF6在ER應(yīng)激存在下的抑制）在另一種ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑Tg治療和HCT116人結(jié)腸癌細胞系中也可以看到（圖S1F-S1I）

模式圖：

R2.

PERK通路的選擇性誘導(dǎo)表明，VMP1缺乏可能不會導(dǎo)致整體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在293T細胞中證實了這一點，其中Tm處理（而不是VMP1 KO）導(dǎo)致ER擴張（圖2A）

而且，Tm誘導(dǎo)的PERK磷酸化可以通過化學伴侶TUDCA和蛋白質(zhì)翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）來阻止，然而由于VMP1缺乏而導(dǎo)致的PERK的磷酸化則不能被抑制（圖2B和2C），以上結(jié)果證明了VMP1 KO細胞中PERK磷酸化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是無關(guān)的。

BAPTA-AM對胞質(zhì)Ca2+的消耗抑制了VMP1中PERK的磷酸化KO 293T細胞(圖2E)。

作者聯(lián)想到VMP1已被既往文獻證明是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的正調(diào)節(jié)因子，于是作者用心臟ER/肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA）抑制劑Tg和環(huán)噻唑酸（CPA），發(fā)現(xiàn)在15分鐘內(nèi)可以增加mPERKDLD的磷酸化（S2B）

在VMP1 KO細胞中，Tg誘導(dǎo)的ER鈣釋放受到損害（圖S2C–S2F）于是作者假設(shè)可能是VMP1 KO細胞中PERK激活是由于SERCA的功能障礙和Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞所引起

并且，與Tg相比，VMP1缺乏僅導(dǎo)致SERCA的輕度功能障礙，并且不會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：（1）與Tg不同，VMP1 KO僅部分降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+含量（圖S2C a n d S2 d）；（2）CDN1163能夠抑制VMP1 KO引起的，但不能抑制Tgin誘導(dǎo)的PERK激活（圖S2G）；和（3）在VMP1 KO細胞中未觀察到ER擴張（圖2A）。

VMP1缺失對SERCA的抑制可能會升高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè)的局部Ca2+濃度，據(jù)報道胞漿Ca2+升高會引發(fā)PERK二聚化。9我們發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM對胞漿Ca2＋的耗竭抑制了VMP1 KO 293T細胞中的PERK磷酸化（圖2E）。即使PERK管腔結(jié)構(gòu)域不存在，情況也是如此（圖2F）。這些結(jié)果表明，通過SERCA抑制增加的局部Ca2+濃度可能以ER應(yīng)激無關(guān)的方式導(dǎo)致PERK活化。

R3

鈣是如何激活PERK的？一種可能的解釋是，某些Ca2+調(diào)蛋白可能與PERK相互作用。

作者用鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，一種先前報道與PERK相關(guān)并促進PERK自磷酸化的Ca2+依賴性磷酸酶，然而，用小干擾RNA敲低鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因并不能抑制PERK的磷酸化（圖S2I和S2J），這說明PERK的激活可能不是由Ca2+調(diào)蛋白與PERK相互作用引起。

?作者假設(shè)PERK可以直接感知局部Ca2+濃度的變化。為了測試這一點，作者表達并純化了63His標記的PERK（CD）（人類PERK的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，殘基563-1116）（圖S2K），并通過熱漂移分析測量了PERK（CD）-Ca2+的相互作用。

值得注意的是，低至10uM濃度的Ca2+能夠提高PERK（CD）的熔化溫度，這表明Ca2+可以與PERK（CD）結(jié)合并穩(wěn)定（圖2G和2H）。有趣的是，Ca2+在提高PERK（CD）的熔化溫度方面比Mg2+表現(xiàn)得更好，（圖2H）。

Mg2+是促進ATP結(jié)合的激酶輔助因子，在MgCl2存在的情況下，Ca2+以濃度依賴的方式促進PERK（CD）磷酸化（圖2I），并在體外促進PERK的二聚化/低聚（圖S2L）。然而，MgCl2不存在時Ca2+對PERK（CD）磷酸化沒有影響（圖2I），這表明Ca2+可能與Mg2+合作激活PERK。此外，離子霉素增加胞漿Ca2+水平也促進了體內(nèi)mPERKDLD的磷酸化（圖2J）。證明了假設(shè)即PERK的胞質(zhì)部分可以在體外和體內(nèi)感知和響應(yīng)Ca2+濃度的變化。

R4

于是作者去探究UPR的另外兩條途徑IRE1a和ATF6在VMP1 KO細胞中是如何被下調(diào)的。有兩種可能性：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕，或者IRE1a和ATF6變得惰性，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激沒有反應(yīng)。我們注意到野生型（WT）細胞在Tm處理后擴張ER，但VMP1 KO細胞沒有（圖3A）。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實際上減弱了，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)積累減少了。

VMP1缺失促進了eIF2a的磷酸化（圖1D a n d S1G），這是蛋白質(zhì)翻譯停滯的標志。

我們通過SUnSET測定測量了翻譯水平，發(fā)現(xiàn)VMP1 KO降低了293T細胞和HCT116細胞的整體翻譯（圖3B）。我們提出假設(shè)：翻譯阻滯可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并抑制IRE1a和ATF6途徑。

為了驗證這一假設(shè)，作者用ISRIB處理293T（WT或VMP1 KO），我們發(fā)現(xiàn)ISRIB在VMP1 KO細胞中恢復(fù)了蛋白質(zhì)翻譯并重新激活了IRE1a和ATF6（圖3B–3D）。因此，以上結(jié)果證明，VMP1缺失通過eIF2a磷酸化減弱全局翻譯來抑制IRE1a和ATF6活性。

R5

PERK（一種UPR和ISR成分）在VMP1 KO細胞中被激活的事實促使我們推測PERK激活有助于翻譯衰減和IRE1a/ATF6抑制。這得到了以下結(jié)果的支持：PERK的基因缺失和藥理學抑制都降低了eIF2a磷酸化和ATF4表達，恢復(fù)了蛋白質(zhì)翻譯，并恢復(fù)了IRE1a（IRE1a磷酸化、XBP1 mRNA剪接和XBP1s誘導(dǎo)）和ATF6信號（ATF6切割和BiP誘導(dǎo)）（圖4A–4D和S3A–S3C）。值得注意的是，與PERK KO細胞相比，VMP1/PERK雙KO（DKO）細胞仍然顯示出翻譯水平和IRE1a/ATF6活性降低，這表明VMP1 KO細胞中存在除PERK之外的其他因子來阻止翻譯并抑制IRE1a和ATF6。

VMP1 KO細胞的一個特征是MERCs異常增加。作者在VMP1 KO293T細胞中觀察到MERCs顯著增加（圖S4A和S4B）。我們想知道這是否減少了翻譯并使IRE1a和ATF6失活。通過引入已報道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體合成接頭（linker）來提高MERCs，蛋白質(zhì)合成減少并抑制Tm誘導(dǎo)的IRE1a信號（XBP1 mRNA剪接、IRE1a磷酸化和XBP1表達）和ATF6信號（BIP mRNA誘導(dǎo)、BIP表達和ATF6切割）（圖5A-5E）。

MERCs在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的Ca2+流量中起著重要作用。在VMP1 KO細胞中，Ca2+在線粒體的表達增加（S4D）。為了進一步證明MERCs在線粒體[Ca2+]升高中的作用，我們敲除了電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1），，VDAC1缺失減少了VMP1 KO細胞中的線粒體[Ca2+]（圖S4E），部分恢復(fù)了整體翻譯，并恢復(fù)IRE1a（XBP1 mRNA剪接）和ATF6（BIP轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)）下游的信號（圖5F–5H）。因此，異常高的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的轉(zhuǎn)運有助于VMP1 KO細胞中IRE1a和ATF6的抑制。

線粒體鈣超載可能對線粒體功能有害，導(dǎo)致線粒體應(yīng)激。4這在VMP1 KO細胞中得到了證實，因為我們觀察到線粒體呼吸受損（圖S4F和S4G）和線粒體活性氧（ROS）增加（圖S4H）。此外，VMP1缺失導(dǎo)致線粒體擴張，這是線粒體應(yīng)激的另一個跡象，可以通過重新引入VMP1來逆轉(zhuǎn)（圖S4A和S4I）。重要的是，這是以不依賴于PERK的方式發(fā)生的，因為敲除PERK不能消除異常的線粒體形態(tài)（圖S4J）。

接下來，我們決定模擬WT細胞中的線粒體應(yīng)激，并分析其對蛋白質(zhì)翻譯和UPR信號的影響。我們使用了三種化學物質(zhì)，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽（MPTP）、寡霉素和多西環(huán)素，分別增加線粒體ROS、損害線粒體呼吸和誘導(dǎo)線粒體擴張（圖S5A-S5C）。與VMP1耗竭類似，這三種化學物質(zhì)誘導(dǎo)的線粒體功能障礙足以減弱全局翻譯并誘導(dǎo)eIF2a磷酸化，但不依賴于PERK，如使用PERK抑制劑所證明的（圖5I）。藥理學誘導(dǎo)的線粒體功能障礙也抑制了Tm或Tgin誘導(dǎo)的IRE1a和ATF6信號（圖5J–5L、S5D和S5E）。這種效應(yīng)不能被VMP1過表達逆轉(zhuǎn)，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，即線粒體應(yīng)激是VMP1缺陷的下游（圖5J–5M）。

因此，除了PERK激活外，在VMP1缺陷的情況下，MERC誘導(dǎo)的線粒體應(yīng)激在減弱蛋白質(zhì)合成和失活UPR的IRE1a和ATF6分支方面起著另一個獨立的調(diào)節(jié)因子的作用。

R7

據(jù)報道，線粒體功能障礙可激活三種ISR激酶（GCN2、PKR和HRI），這三種激酶與PERK平行，匯聚到eIF2a磷酸化和隨后的蛋白質(zhì)翻譯減弱。2我們在VMP1 KO細胞中觀察到PKR的磷酸化，但沒有觀察到GCN2的磷酸化。這表明PKR的激活（圖6A和6B）。為了研究ISR在翻譯衰減和URP失活中的作用，我們在VMP1 KO細胞中分別敲除了GCN2、PKR和HRI（圖6C-6E）。與PERK缺失類似，PKR-KO或HRI-KO部分挽救了VMP1 KO細胞中的整體翻譯，抑制了eIF2a的磷酸化，并恢復(fù)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的IRE1a和ATF6的激活。相比之下，GCN2 KO沒有這種影響（圖6F–6H）。因此，PKR和HRI，而不是GCN2，是解釋VMP1缺失誘導(dǎo)的翻譯衰減和IRE1a/ATF6抑制的ISR途徑。

有趣的是，與PERK-KO不同，PKR或HRI的消融并不影響ATF4的表達。另一方面，盡管GCN2的缺失對eIF2a磷酸化和蛋白質(zhì)翻譯沒有影響，但降低了ATF4的表達（圖6F）。

這些結(jié)果表明，在VMP1 KO的情況下，AFT4以eIF2a磷酸化非依賴性的方式調(diào)節(jié)

R8

在解決了VMP1缺失對三種UPR途徑的差異調(diào)節(jié)機制后，我們探索了這種調(diào)節(jié)在基礎(chǔ)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下的生理意義。在基礎(chǔ)條件下，VMP1缺失特異性激活了PERK通路。同時，與WT細胞相比，VMP1 KO細胞的細胞增殖率降低。有趣的是，PERK的基因缺失或藥理學抑制，或增加ISRIB的全局翻譯，恢復(fù)了VMP1 KO細胞中的細胞增殖，表明PERK激活及其后的翻譯抑制損害了細胞增殖（圖7A、7B和S6A）。

接下來，我們研究了VMP1缺乏在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激背景下的影響。為此，通過用Tm處理長達5天，用ER應(yīng)激攻擊細胞。正如預(yù)期的那樣，WT和VMP1 KO細胞中的細胞活力逐漸降低。

有趣的是，雖然VMP1耗竭在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段降低了細胞活力，但在晚期變得有益，在第3天發(fā)生轉(zhuǎn)變，也就是細胞活力急劇下降的那一天（圖7C）。VMP1 KO的抗細胞死亡作用在第3天變得明顯，當時WT 293T細胞中的細胞死亡百分比增加（圖7D）。通過使用其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑（Tg或BFA）或另一種細胞系（HCT116），也可以觀察到VMP1 KO對細胞活力的影響的逆轉(zhuǎn)以及VMP1 KO在長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的抗細胞死亡作用（圖S6B和S6C）。

UPR可以是保護性的，也可以是促凋亡的，這在很大程度上取決于UPR的強度、動力學和下游信號。3為了進一步揭示VMP1 KO對細胞活力影響的轉(zhuǎn)變機制，檢測了Tm處理后第1天至第3天細胞中的UPR標記物。BiP是ATF6下游的一種適應(yīng)性UPR標記物。我們發(fā)現(xiàn)VMP1 KO在整個觀察時間段內(nèi)抑制了BiP的激活（圖7E）。XBP1s和JNK磷酸化分別代表IRE1a下游的適應(yīng)性和末端UPR信號。4在WT細胞中，XBP1s的表達在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段（第1天和第2天）高度上調(diào)，但在第3天下降。JNK磷酸化表現(xiàn)相反，僅在第3天出現(xiàn)。值得注意的是，在整個觀察時間段內(nèi)，XBP1誘導(dǎo)和JNK磷酸化都受到VMP1 KO的抑制（圖7E）。

我們發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段，VMP1 KO細胞中XBP1的缺乏損害了細胞的生存能力，因為過表達的XBP1恢復(fù)了生存能力（圖7F[頂部]和S6D）。

使用IRE1a抑制劑預(yù)防WT細胞中的IRE1a過度激活可降低長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的細胞死亡率（圖7F，底部）。與IRE1a通路類似，PERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的細胞命運決定中發(fā)揮雙重作用。盡管早期激活通過降低ER蛋白負荷啟動即時適應(yīng)性反應(yīng)，但PERK的過度激活可通過誘導(dǎo)CHOP（凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）觸發(fā)細胞死亡。4我們發(fā)現(xiàn)，在VMP1 KO細胞中，CHOP的表達在第1天高于WT，但在第2天和第3天被WT超過。因此，VMP1 KO以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無關(guān)的方式開啟PERK，但將信號強度保持在中等水平，以防止終末UPR的發(fā)生，但在延長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下保留適應(yīng)性UPR。無論哪種方式，這種優(yōu)雅平衡的擾動都可能導(dǎo)致細胞死亡的增加，并會抑制VMP1缺乏在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的保護作用，正如已經(jīng)證明的那樣

通過mPERKDLD過表達和PERK KO（圖7G和S6E）。此外，用ISRIB恢復(fù)蛋白質(zhì)翻譯或通過VDAC1 KO抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體Ca2+流動，如前所述，這恢復(fù)了UPR，也損害了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后期VMP1缺乏的保護作用（圖7H和7I）。總之，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段，VMP1缺失通過抑制適應(yīng)性UPR來損害細胞活力，并在應(yīng)激持續(xù)且適應(yīng)性UPR已經(jīng)減弱時通過降低末端UPR來保護細胞免于死亡（圖7J）