? ? 今天給大家介紹一篇來自新加坡國立大學的張勇教授的研究工作，新加坡國立大學生物醫(yī)藥工程學院張勇教授團隊多年來致力于納米熒光材料制備和應用研究，主要研究方向為納米熒光材料的可控制備、表面改性和功能化，這篇綜述主要圍繞了熒光編碼微球的制備方法、熒光編碼微球的主要生化應用（核酸、蛋白質以及CTC檢測）、基于智能手機或者可折疊微流控芯片的POCT的應用以及主要問題和未來的展望等四大板塊內容進行闡述。

【背景介紹】

? ? 熒光編碼微球具有優(yōu)良的比表面積，提供了更加靈敏的檢測，同時熒光編碼微球具有編碼以及解碼過程簡單，編碼容量大以及可大批量制備等優(yōu)勢。熒光編碼微球一般利用熒光的發(fā)射波長以及強度進行編碼。熒光編碼微球的編碼元件包括半導體的量子點、有機熒光染料以及上轉換納米顆粒等主要編碼元件。

? ? 半導體的量子點的發(fā)射光譜窄，熒光穩(wěn)定性好，較寬的的激發(fā)光譜可以實現多種量子點的單一波長激發(fā)。有機熒光染料價格低廉、種類較多，適用于多種編碼方法以及多種材質的微球，不同批次間的熒光均一性較好。上轉換納米顆粒利用近紅外發(fā)激光，可以避免生物分子背景熒光的干擾，另外可以避免不同發(fā)射波長間的共振能量轉移現象。

【熒光編碼微球的制備方法】

? ??有機溶劑溶脹法：聚合物微球在有機溶劑中溶脹，染料或者量子點等滲入微球內部，移除有機溶劑之后，微球的聚合物網絡發(fā)生收縮，并將染料或者量子點包裹在微球內部，關鍵點：調整染料或者量子點的種類或者濃度可以實現不同的熒光編碼。

? ? 方法改進：利用有機溶劑溶脹-溶劑蒸發(fā)法，利用量子點以及微球的氯仿溶液在密封條件下攪拌2h溶脹微球，之后將溶液在空氣氛圍下攪拌2h，隨著氯仿的揮發(fā)，溶液中的量子點的濃度逐步升高，促使量子點滲入微球內部，該方法可以提高熒光編碼微球的熒光穩(wěn)定性以及均一性。

? ??利用該方法最典型的的商業(yè)產品就是Luminex公司的microPlex微球，主要就是利用紅色以及近紅外兩種染料對聚苯乙烯微球進行編碼，兩種染料可以分別設定10個濃度梯度，得到100種熒光編碼微球，并開發(fā)了對應xMAP多重樣本分析平臺，該方法增加了包裹的效率以及量子點分布的均一性。

? ??熒光編碼微球第二種主流制備方法是層層的自組裝法（表面交聯法/利用疏水作用的結合）。

? ??層層自組裝法：利用聚電解質以及相反電性量子點之間的靜電吸附作用，可以實現聚電解質以及量子點在微球表面的交替結合。調整聚電解質以及量子點結合的層數，可以控制微球表面負載的量子點的數量。

? ??表面交聯法：為了實現微球表面的固相引物的合成，Nanthakumar等利用高度交聯，非溶脹的聚苯乙烯微球，通過在微球表面共價交聯BODIPY染料分子，實現熒光編碼寡核苷酸合成載體的制備。微球表面交聯的染料數量由染料的濃度而定，利用濃度逐級稀釋（10倍）的染料溶液，得到四種強度的熒光編碼。

? ??疏水作用結合：Hu等利用利用疏水作用的方法制備了量子點摻雜的介孔二氧化硅微球，利用該方法制備的量子點摻雜的介孔二氧化硅微球，編碼微球表面結合聚乙二醇后包裹二氧化硅殼層。二氧化硅包裹后的熒光微球具有非常高的穩(wěn)定性，避免溶劑中的量子點泄露以及化學誘導的熒光。

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? ??熒光編碼微球還有通過包埋法來進行制備的，比如利用有機染料來進行編碼，有機染料編碼：Zhang利用單分散聚苯乙烯微球進行種子聚合，羅丹明6G（R6G）染料在聚合過程中被包埋在殼層內，調整染料的濃度可以準確控制微球的熒光強度，制備了12種不同熒光強度的熒光編碼微球。Liu制備了烯丙基化的羅丹明B、熒光素以及尼羅紅，將染料與聚苯乙烯的單體混合，通過分散聚合制備了三種熒光編碼的微球，染料分子共聚在微球內部。有機溶膠-凝膠法（三聚氰胺–甲醛樹脂微球），染料分子首先與樹枝狀的三聚氰胺-甲醛預聚物的分子結合，在預聚物進一步生成微球的同時，將染料分子包裹在微球內部。該方法對多種染料都有很高的包裹率，微球具有較高的熱以及機械的穩(wěn)定性，保存過程中幾乎無染料的泄露。

??? 量子點編碼的方法：Yang等利用可聚合的表面活性劑作為乳化劑以及相轉移劑，通過改進的細乳液聚合，將3-巰基丙酸修飾的CdTe量子點均勻包裹在聚苯乙烯微球內部。聚苯乙烯具有致密結構以及疏水特性，使得微球的熒光幾乎不受到ph的影響。Graf的將聚乙烯吡咯烷酮修飾的量子點吸附到氨基功能化的二氧化硅微球的表面，在微球表面包裹二氧化殼層，將量子點固定在微球內部。Vaidya等在懸浮聚合過程中，將量子點包裹在聚乙烯微球內部，調整量子點的顏色以及數量實現了熒光編碼微球的制備。（激光共聚焦顯微鏡分析證明，量子點在微球內部呈現多個團聚體分布，微球的發(fā)射光譜與非聚集態(tài)的量子點相比沒有發(fā)生位移。）

? ? 刺激響應性的水凝膠的方法：Kuang課題組利用N-異丙基丙烯酰胺與4-乙烯基吡啶共聚物（PNIPVP）水凝膠的pH響應性，在酸性的條件下將溶脹的凝膠微球與水溶性的量子點進行共孵育，微球離心分散在ph=7的水溶液中，凝膠網絡收縮將量子點包裹在微球內部，量子點在微球內均勻分布，將不同種類的量子點按照不同比例包裹在凝膠微球內，可以獲得不同熒光編碼的凝膠微球。

? ? 微流控技術法來制備熒光編碼微球：Gerver課題組利用了全自動的微流控器件，制備了鑭系的納米熒光材料編碼的親水性聚合物微球。鑭系的納米熒光材料、聚乙二醇雙丙烯酸甲酯以及光引發(fā)劑等溶劑在甲醇中作為分散相，在流體通道中生成液滴，再經紫外線照射引發(fā)液滴內聚合反應，就得到熒光編碼微球。Ji等利用微流控技術，制備了量子點編碼的海藻酸鈣微球，含有量子點、海藻酸鈉的液滴與連續(xù)流動相中的鈣離子作用，生成了包裹量子點的海藻酸鈣凝膠微球。利用金字塔狀的微流體網絡可以實現量子點逐級濃度梯度的自動化。

? ? 最后總結下熒光編碼微球制備方法的主要優(yōu)點以及不足之處，如下表所示。

【熒光編碼微球的主要生化應用】

? ? 熒光微球的生化檢測主要利用兩種方式，一種為懸浮芯片技術，另外一種方式基于微流控的技術或者微井陣列的方式。

? ? 懸浮芯片的原理如下圖（懸浮芯片的檢測原理示意圖）所示：編碼微球作為免疫檢測的載體，所攜帶的編碼信息同時用作表面結合探針分子的標記。該芯片的分析過程為目目標分子先與編碼微球表面負載的探針分子結合，再進一步與帶有熒光標記的報告分子結合，形成夾心式結構的復合體，微球帶有的編碼信息用于區(qū)分目標分子的種類，而報告分子的信號強弱則反映目標分子的含量。

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? ? Simoa技術將約250,000個捕獲抗體包被在2.7μm的小磁珠上，檢測時加入生物素標記的檢測抗體及親和素偶聯的酶和底物，通過一層油將單個磁珠分別封閉在238,000個4.5μm的反應孔（Well）中進行反應。由于每個小孔的反應體系僅僅為50飛升，比傳統(tǒng)ELISA小20億倍，這時小孔中即使只有一個分子，其催化底物就可產生3000個熒光分子，通過CCD攝像頭即可捕獲到信號，利用泊松分布理論可計算出陽性熒光小孔（OnWell）對應的蛋白濃度值，實現數字化單分子檢測的愿望。

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