時空簡訊第42期。

空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的新興技術(shù)，它能夠定量測量細胞的基因表達，追蹤細胞在組織空間的精確位置，揭示健康和疾病狀態(tài)下細胞-細胞相互作用，是生命科學和生物醫(yī)學領域中重要的技術(shù)突破之一。根據(jù)如何獲取細胞在組織中不同空間位置的信息，該技術(shù)主要可分為基于顯微切割、原位雜交、原位測序和微陣列技術(shù)等類型。

為快速、高效地傳播、共享有關空間和單細胞多組學技術(shù)的開發(fā)及應用，華大時空特推出時空/單細胞技術(shù)專題簡訊。遴選空間和單細胞多組學新技術(shù)開發(fā)、技術(shù)革新與評測類的代表性文獻，持續(xù)、針對性地進行精要解讀，敬請關注。

空間和單細胞多組學技術(shù)的發(fā)展，能夠讓我們深入理解健康和疾病狀態(tài)下細胞的結(jié)構(gòu)與功能。在此，遴選了9篇描述空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及其工作原理的優(yōu)質(zhì)前沿文章，展示了當前基于不同方法獲取細胞空間位置信息的空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)進展情況，供了解參考。

綜述/Review

空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)及其發(fā)展方向

Nature Biotechnology?[IF：68.164]

① 比較了傳統(tǒng)原位雜交定位少量特定分子和空間轉(zhuǎn)錄組學（spatial transcriptomics，ST）定量完整組織切片轉(zhuǎn)錄組的特點，總結(jié)了ST的三個生物學應用場景：闡明組織的細胞類型組成、研究細胞間的相互作用模式和發(fā)現(xiàn)不同組織細胞類型間的配體-受體對。

② 將ST技術(shù)分為基于測序的ST（sequencing-based ST，sST）和基于成像的ST（imaging-based ST，iST）兩大類，并總結(jié)了sST和iST的主要應用實例，描述了其表征和驗證的關鍵指標、實驗框架，如總結(jié)了不同sST技術(shù)的空間位置信息的索引生成策略，iST技術(shù)原位標記RNA分子的方式和圖像處理的主要步驟等。

③ 展望了ST技術(shù)未來的發(fā)展方向：原位檢測轉(zhuǎn)錄本剪接、基因組結(jié)構(gòu)變異、表觀基因組修飾和調(diào)控、蛋白互作和原位蛋白測序，細胞分割和空間分辨率提高下的細胞互作研究，利用基因編輯分子記錄技術(shù)的四維細胞轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)測量。（Yuki）

詳細解讀可點擊推文了解>>>Nat Biotechnol | 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及其發(fā)展方向

The expanding vistas of spatial transcriptomics.

2022.10.03, DOI: 10.1038/s41587-022-01448-2

綜述；空間轉(zhuǎn)錄組，技術(shù)分類，工作原理，應用場景，發(fā)展方向；Luyi Tian, Fei Chen, Evan Z. Macosko; Broad Institute of Harvard and MIT, Harvard Stem Cell and Regenerative Biology, Massachusetts General Hospital; USA.

顯微切割技術(shù)/Region of Interest Selection

固定組織中RNA和蛋白質(zhì)的多重數(shù)字空間分析

Nature Biotechnology?[IF：41.058]

① 描述了數(shù)字空間分析（Digital Spatial Profiling，DSP）技術(shù)，這是一種適用于福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品的蛋白質(zhì)或RNA進行高度多重空間分析的方法，它將傳統(tǒng)免疫組化和原位雜交技術(shù)發(fā)展為一個由硬件、軟件和nCounter組成的集成系統(tǒng)。

② DSP依賴于：使用寡核苷酸標簽對蛋白質(zhì)或RNA進行多重讀出；通過光裂解（photocleavable，PC）接頭連接到親和試劑（抗體或RNA探針）上的寡核苷酸標簽；光切割光投射到組織樣本上，在覆蓋1~5,000個細胞的感興趣區(qū)域（ROI）中以任何空間模式釋放PC寡核苷酸。

③ DSP能夠使用抗體讀數(shù)在ROI內(nèi)實現(xiàn)單細胞敏感性，RNA檢測可適用低至約600個單獨的mRNA轉(zhuǎn)錄本。

④ 使用nCounter系統(tǒng)顯示了淋巴、結(jié)直腸腫瘤和自身免疫組織中多達44種蛋白質(zhì)和96個基因的空間分析，并使用下一代測序展示了1,412個基因的分析。（Lina）

Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.

2020.05.11，DOI：10.1038/s41587-020-0472-9

研究文章；固定生物組織，蛋白質(zhì)，RNA，多重空間分析，空間轉(zhuǎn)錄組，數(shù)字空間分析；Christopher R. Merritt, Joseph M. Beechem; NanoString Technologies, Inc.; USA.

Geo-seq：冷凍切片組織樣本的空間轉(zhuǎn)錄組學分析

Nature Protocols?[IF: 12.423]

① 開發(fā)了一種結(jié)合激光顯微切割（LCM）和scRNA-seq的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)Geo-seq，允許解析感興趣區(qū)域的少量（10個）細胞的轉(zhuǎn)錄組信息，同時還能保留細胞原有位置信息。

② Geo-seq首先對組織進行染色，然后通過LCM感興趣的細胞，這些切割下來的細胞通過Smart2-seq的方法進行建庫并用高通量測序；從組織收集和顯微切割到測序的整個流程需要約5 d，數(shù)據(jù)分析需要1~2周，這取決于數(shù)據(jù)量和處理器的速度。

③ 使用Geo-seq建立了原腸胚中期小鼠胚胎的3D轉(zhuǎn)錄組圖譜，并以高精度將單個外胚層細胞映射回體內(nèi)胚胎位置。此外，Geo-seq還被用于描繪發(fā)育過程中小鼠大腦的細胞身份、研究人類精子的病理狀態(tài)，以及對小鼠肝細胞進行功能表征。（黎萬順/Lina）

Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq.

2017.02.16，DOI：10.1038/nprot.2017.003

研究文章；小鼠，胚胎，腦，精子，顯微切割，scRNA-seq，Smart2-seq，空間轉(zhuǎn)錄組，Geo-seq；Jun Chen, Guangdun Peng，Naihe Jing；中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，南開大學；中國

原位雜交技術(shù)/Single-Molecule FISH

RNA seqFISH+：實現(xiàn)生物組織中轉(zhuǎn)錄組的超分辨成像

Nature?[IF：43.070]

① 展示了序貫熒光原位雜交技術(shù)的升級版seqFISH+，該技術(shù)利用序列雜交和標準共聚焦顯微鏡成像即可獲得單細胞中10,000個基因的超分辨率成像和多路復用。

② 在純凈的NIH/3T3成纖維細胞中檢測seqFISH+的實際效率，發(fā)現(xiàn)其靈敏度比scRNA-seq更高；進一步使用相同的10,000個基因探針觀察小鼠腦室下區(qū)皮層和嗅球獨立組織切片，總共收集了2,963個細胞中10,000個基因的轉(zhuǎn)錄圖譜，覆蓋面積約為0.5 mm2。

③ seqFISH+能夠很好地描述組織中的轉(zhuǎn)錄組，克服了光學擁擠，展現(xiàn)了seqFISH+在組織中生成空間單細胞圖譜的強大應用潛力；與現(xiàn)有方法相比，seqFISH+可以實現(xiàn)商業(yè)共聚焦顯微鏡的超分辨率成像，并可推廣到染色體和蛋白質(zhì)成像。（馮衛(wèi)青/張珊）

Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+.

2019.03.25，DOI：10.1038/s41586-019-1049-y

研究文章；小鼠，大腦皮層，腦室下區(qū)，細胞定位，空間轉(zhuǎn)錄組，熒光原位雜交，seqFISH+；Chee-Huat Linus Eng, Long Cai; California Institute of Technology; USA.

Split-FISH：生物組織中的高特異性多路RNA成像

Nature Methods?[IF: 30.822]

① 提出了一種多重熒光原位雜交方法split-FISH，通過split探針的設計和優(yōu)化，減少了雜交脫靶背景信號，大大降低了非透明化組織中的假陽性信號，實現(xiàn)更精確的RNA分析。

② 在A549細胞中使用粘蛋白5AC、寡聚粘液/凝膠形成（MUC5AC）轉(zhuǎn)錄本上的單分子FISH優(yōu)化split探針序列，發(fā)現(xiàn)環(huán)形“橋”（bridge）具有更高的靶向信號且具有更高的特異性；優(yōu)化split-FISH工作流程后，能夠執(zhí)行多次雜交和洗滌（至少20輪），而沒有任何可觀察到的FISH信號或RNA計數(shù)損失。

③ 通過量化單細胞中317個基因的分布和豐度，證明了split-FISH對各種小鼠組織（腎臟、肝臟、卵巢）的有效性，并揭示了復雜組織中轉(zhuǎn)錄組空間調(diào)節(jié)的不同定位模式。（孫豐羽/Lina）

Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.

2020.06.15，DOI:?10.1038/s41592-020-0858-0

研究文章；小鼠，腦，腎臟，肝臟，卵巢，RNA分析，空間轉(zhuǎn)錄組，split-FISH；Jolene Jie Lin Goh, Nigel Chou, Kok Hao Chen; Genome Institute of Singapore; Singapore.

原位測序技術(shù)/In?Situ?Sequencing

STARmap：單細胞分辨率下3D完整組織原位RNA測序

Science?[IF：41.058]

① 開發(fā)一種3D完整組織RNA測序技術(shù)——STARmap（spatially-resolved transcript amplicon readout mapping），它集成了水凝膠-組織化學、靶向信號放大和原位測序，為3D原位轉(zhuǎn)錄組學定義了一個平臺。

② 將STARmap應用于小鼠大腦切片中，能以單細胞分辨率同時映射160~1,020個基因，證實該技術(shù)具有高效率、準確性和可重復性的功能特點。

③ 擴展到更大3D組織塊，STARmap可識別和描述跨越立方毫米級（> 30,000個細胞）的興奮性神經(jīng)元亞型的分子定義的梯度分布，以及許多抑制性神經(jīng)元亞型的短程3D自聚類。（Lina）

Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.

2018.06.21，DOI：10.1126/science.aat5691

研究文章；小鼠，大腦，完整組織，單細胞分辨率，空間轉(zhuǎn)錄組，STARmap；Xiao Wang, William E. Allen, Garry P. Nolan4, Felice-Alessio Bava4, Karl Deisseroth; Stanford University; USA.

原位捕獲技術(shù)/Next-Generation Sequencing with Spatial Barcoding

小鼠胚胎的單細胞空間轉(zhuǎn)錄組分析

Science?[IF：49.962]

① 提出了一種將單細胞基因表達差異與空間背景結(jié)合起來的新方法——sci-Space，該方法能夠在保留單細胞分辨率的同時在更大的尺度上解決空間異質(zhì)性。

② 應用sci-Space對來自2個發(fā)育第14天的小鼠胚胎的14個矢狀面切片進行了分析，繪制出121,909個細胞核的基因表達圖譜和近似空間坐標，證明了sci-Space可以顯示轉(zhuǎn)錄組中的任何基因，類似于原位雜交。

③ 通過分析圖譜，鑒定出數(shù)千個基因呈現(xiàn)出與解剖結(jié)構(gòu)有關的表達模式，在分析的細胞類型中結(jié)締組織祖細胞和神經(jīng)元的空間自相關基因最多，每個細胞中分別平均有12,150±2,270、8,623±3,846個基因，表明sci-Space能夠區(qū)分由單個細胞類型驅(qū)動的基因表達空間模式，以及跨多個細胞類型的基因表達空間模式。

④ 利用空間信息對各種類型的細胞進行亞型注釋，揭示了細胞類型在空間模式化程度方面存在很大差異，表明這些細胞亞型在體內(nèi)以位置依賴的方式行事；采用擬時序分析，得出神經(jīng)膠質(zhì)細胞、輻射狀細胞和神經(jīng)元三種腦細胞隨時間進行分化和遷移。（WRQ/Lina）

Embryo-scale, single-cell spatial transcriptomics.

2021.07.02, DOI: 10.1126/science.abb9536

研究文章；小鼠，胚胎，空間標記，基因表達，sci-Space；Sanjay R. Srivatsan，Mary C. Regier，Jay Shendure, Kelly R. Stevens, Cole Trapnell; University of Washington, Institute for Stem Cell & Regenerative Medicine, Brotman Baty Institute for Precision Medicine; USA.

Seq-Scope：空間轉(zhuǎn)錄組顯微檢測

Cell?[IF: 41.582]?

① 基于空間條形碼和測序平臺，開發(fā)了可以實現(xiàn)亞微米分辨率的的空間轉(zhuǎn)錄組學新技術(shù)——Seq-scope，能較好地揭示基因空間表達信息，為空間單細胞和亞細胞分析提供了一個通用的解決方案。

② Seq-scope的中心到中心（center-to-center）分辨率為0.5~0.8 μm（平均約0.6 μm），可與光學顯微鏡相媲美，且具有高效的轉(zhuǎn)錄組捕獲output（平均高達23~27 UMIs/μm2），當聚集到單細胞區(qū)域時，其轉(zhuǎn)錄組捕獲output（平均4,700 UMIs/個細胞）基本與傳統(tǒng)scRNA-seq相當。

③ 利用Seq-scope，清楚顯示了肝臟和結(jié)腸的顯微細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄組圖像，揭示了肝臟和結(jié)腸的空間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。（WRQ/Lina）

Microscopic examination of spatial transcriptome using Seq-Scope.

2021.06.10, DOI: 10.1016/j.cell.2021.05.010

研究文章；小鼠，肝臟，結(jié)腸，肝臟炎癥性纖維化，空間轉(zhuǎn)錄組，Seq-Scope，亞微米細胞分辨率；Chun-Seok Cho, Jingyue Xi, Jun Hee Lee; University of Michigan Medical School, University of Michigan School of Public Health; USA.

用于組織原位分析的高分辨空間轉(zhuǎn)錄組方法

Nature Method?[IF: 28.547]

① 開發(fā)了高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學方法——HDST（High-Definition Spatial Transcriptomics），可以從含有密集空間條形碼磁珠的組織切片中捕獲RNA，用于空間分辨的基因表達分析，為研究健康和疾病組織結(jié)構(gòu)和功能提供了更高分辨率的技術(shù)方法。

② HDST是將條形碼的poly(d)T寡核苷酸沉積到2 μm孔中，通過順序雜交和糾錯策略解碼它們的位置，然后將冷凍組織切片置于解碼的載玻片上，染色和成像后捕獲RNA，最后應用RNA-seq進行分析。

③ 將HDST應用于小鼠大腦的主嗅球（main olfactory bulb，MOB）和組織學三級乳腺癌HER2+患者的腫瘤切片中，證實了其是一種測量原位空間信息的高分辨方法，HDST的分辨率分別為ST（Spatial Transcriptomics）、Slide-Seq的1,400倍、25倍。（毛學彬/WRQ/Lina）

High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling.

2019.09.09, DOI: 10.1038/ s41592-019-0548-y

研究文章；小鼠，大腦，嗅球，乳腺，乳腺癌，原位信息，HDST; Sanja Vickovic, G?kcen Eraslan, Fredrik Salmén, Johanna Klughammer, Linnea Stenbeck, Joakim Lundeberg; Broad Institute of MIT and Harvard, KTH Royal Institute of Technology, Stanford University; USA.

關于時空組學技術(shù)Stereo-seq：

華大自主研發(fā)的時空組學技術(shù)Stereo-seq，是一項實現(xiàn)超高通量、超高精度的全景式時空轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。Stereo-seq通過時空捕獲芯片，結(jié)合原位RNA捕獲，實現(xiàn)了500 nm的分辨率，最大捕獲面積可達13 cm×13 cm，成為全球領先的能同時實現(xiàn)“納米級分辨率”和“厘米級全景視場”的技術(shù)，且實現(xiàn)了基因與影像同時分析。與當前其他技術(shù)相比，在相同的精度下，Stereo-seq具備更靈敏和更強的mRNA捕獲能力。

Stereo-seq目前已被成功應用到動物胚胎發(fā)育、植物發(fā)育、腦科學、腫瘤等多個不同領域。2022年5月，深圳華大生命科學研究院聯(lián)合多家機構(gòu)在Cell出版社官網(wǎng)以時空組學聯(lián)盟（STOC）專題的形式發(fā)布了全球首批生命時空圖譜，這是首次從時間和空間維度上對生命發(fā)育過程中的基因和細胞變化過程進行超高精度解析，為認知器官結(jié)構(gòu)、生命發(fā)育、人類疾病和物種演化提供全新方向。除了生命時空圖譜的繪制，時空組學技術(shù)Stereo-seq在疾病病理、腦科學等研究領域也發(fā)揮了重要作用。