2023年11月10日，

深圳市人民醫(yī)院黃維教授團(tuán)隊(duì)與青蓮百奧

合作在《

Biomedicine?&?Pharmacotherapy?

》( IF =7.5 )發(fā)表題為“The enhancement effect of small molecule Lyb24 reveals AzoR as a novel target of polymyxin B?”的研究成果。該研究通過(guò)化合物篩選發(fā)現(xiàn)小分子Lyb24增強(qiáng)和恢復(fù)了多粘菌素B（PB）對(duì)革蘭氏陰性病原體的療效，進(jìn)一步利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)（TPP）發(fā)現(xiàn)Lyb24的作用靶點(diǎn)AzoR，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

青蓮百奧總經(jīng)理李京麗、COO孫龍欽、CTO趙焱博士作為作者之一參與本研究，青蓮百奧為本研究提供熱蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)。

期刊：

Biomedicine & Pharmacotherapy

影響因子：

7.5

發(fā)表時(shí)間：

2023年11月10日

發(fā)表單位：

深圳市人民醫(yī)院

研究思路

研究結(jié)果

一、Lyb24增強(qiáng)了PB的活性

研究人員從肺炎克雷伯菌ATCC 13883中鑒定了15種單一濃度20 μg/ml（在0.25 μg/ml PB存在下>50%抑制）的活性化合物。其中，小分子Lyb1和PB聯(lián)合使用表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制效果，達(dá)到75.9%，Lyb1和PB之間的部分抑菌濃度指數(shù)FICI< 0.5（圖1A-B）。由于 Lyb1是通過(guò)篩選具有隨機(jī)結(jié)構(gòu)的化合物而獲得的，作者推測(cè)結(jié)構(gòu)類似物可能是更有效的化合物。因此利用PubChem篩選了28個(gè)結(jié)構(gòu)與Lyb1相似（相似度> 85%）的化合物。其中某些化合物在肺炎克雷伯菌ATCC 13883中最小抑菌濃度MIC值過(guò)高，即使在允許的最高濃度下也不能被抑制，無(wú)法計(jì)算FICI。最后選擇小分子Lyb24進(jìn)行深入研究，與PB聯(lián)合使用時(shí)對(duì)肺炎克雷伯菌有效（FICI < 0.188）（圖1C-D）。

圖1 Lyb24增強(qiáng)了PB對(duì)革蘭氏陰性菌的療效

Lyb24在鮑曼不動(dòng)桿菌（FICI =0.375）、銅綠假單胞菌（FICI = 0.375）和大腸桿菌（FICI = 0.188）中也觀察到了與PB的協(xié)同作用（圖1E）。此外，對(duì)Lyb24和PB非肽的組合進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示無(wú)協(xié)同效應(yīng)，說(shuō)明協(xié)同效應(yīng)不是由于PB對(duì)膜的破壞從而使Lyb24達(dá)到其目標(biāo)（圖1F）。并進(jìn)一步在mcr-1和mgrB缺失菌株證實(shí)了Lyb24在不同抗性機(jī)制上的增強(qiáng)PB活性（圖1G）。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)揭示Lyb24增強(qiáng)機(jī)制

接下來(lái)研究人員采用蛋白質(zhì)組分析來(lái)比較肺炎克雷伯菌（存在或不存在Lyb24、PB或Lyb24與PB結(jié)合）的蛋白表達(dá)。PB是一種陽(yáng)離子抗菌肽（CAMP），其最初與脂多糖（LPS）的脂質(zhì)A基于正負(fù)電荷的相互結(jié)合而發(fā)揮抗菌作用。因此對(duì)檢測(cè)到的參與CAMP抗性的差異表達(dá)蛋白特別感興趣（圖2A），這些差異蛋白有助于將4-氨基-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）添加到脂質(zhì)A帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)中，這是細(xì)菌對(duì)PB產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PB和Lyb24結(jié)合的L-Ara4N-脂質(zhì)A偶聯(lián)物降低，表明Lyb24抑制了脂質(zhì)A修飾水平（圖2B）。

圖2 Lyb24抑制脂質(zhì)A修飾

此外，研究人員通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Lyb24影響細(xì)胞膜的通透性和完整性，將PB與Lyb24聯(lián)合使用，可使細(xì)菌的膜電位去極化。透射電鏡（TEM）圖像顯示細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏。

三、Lyb24蛋白相互作用譜分析

為了檢測(cè)活細(xì)菌中Lyb24蛋白的相互作用，通過(guò)熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了整個(gè)蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的變化。通過(guò)比較存在或不存在Lyb24培養(yǎng)的細(xì)菌在不同梯度溫度處理下的細(xì)胞圖譜，共鑒定出1098個(gè)蛋白，其中613個(gè)存在顯著差異。隨著化合物的加入，197個(gè)蛋白的熱穩(wěn)定性提高，其余416個(gè)蛋白的熱穩(wěn)定性降低（圖3A）。其中熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的蛋白質(zhì)中AzoR與II型NADH-氧化還原酶（NDH-2）具有相同的NADH-氧化還原酶作用，而多粘菌素的另一種作用方式是抑制細(xì)菌內(nèi)膜中重要的呼吸酶(NDH-2)。利用表面等離子共振（SPR）和差示掃描熒光法（DSF）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)明Lyb24與AzoR相互作用并增強(qiáng)PB的抗菌活性（圖3B-E）。

圖3 與AzoR的相互作用與細(xì)菌對(duì)PB的敏感性和 Lyb24的協(xié)同效應(yīng)相關(guān)

通過(guò)構(gòu)建AzoR敲除菌株，發(fā)現(xiàn)AzoR敲除菌株中Lyb24對(duì)PB的協(xié)同效應(yīng)減弱了，AzoR補(bǔ)體菌株恢復(fù)了對(duì)PB的敏感性和Lyb24的協(xié)同效應(yīng)。這些結(jié)果表明，通過(guò)抑制AzoR的功能可以增強(qiáng)PB的抗菌活性。然而，過(guò)表達(dá)AzoR的菌株中Lyb24對(duì)PB的協(xié)同作用并沒(méi)有改變（圖3F-H）。

四、Lyb24和PB對(duì)AzoR活性的影響

對(duì)不同濃度的Lyb24或PB進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，研究其對(duì)AzoR的抑制作用。結(jié)果表明，Lyb24是奎諾二甲基丁酸酯的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（圖4A-F）。進(jìn)一步驗(yàn)證了Lyb24和PB（亞致死濃度）對(duì)鄰苯二酚等醌類藥物的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，在沒(méi)有外源物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基中沒(méi)有觀察到(圖4 G ) 。這些結(jié)果表明Lyb24和PB都能與AzoR結(jié)合并影響其功能，這可能是PB活性增強(qiáng)的一個(gè)原因。

圖4 Lyb24和PB對(duì)AzoR活性的抑制作用

研究人員通過(guò)結(jié)構(gòu)分析表明，Lyb24通過(guò)pi-pi堆疊和AzoR的環(huán)η4與黃素單核苷酸（FMN）的異氧嘧啶環(huán)結(jié)合。并進(jìn)一步利用小鼠肺炎模型證實(shí)了Lyb24增強(qiáng)了PB在體內(nèi)的抗菌活性。

研究總結(jié)

本研究提供了一種潛在的治療方案，通過(guò)聯(lián)合Lyb24和PB治療革蘭氏陰性耐藥的細(xì)菌感染。研究結(jié)果不僅解釋了Lyb24的協(xié)同效應(yīng)，并確證了AzoR作為PB新靶點(diǎn)從而擴(kuò)展了對(duì)PB的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為PB佐劑的開(kāi)發(fā)提供了新的候選機(jī)制。

青蓮百奧合作文章

青蓮百奧深度參與眾多前沿研究，與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)科學(xué)院、軍事醫(yī)學(xué)研究院、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心、四川大學(xué)華西醫(yī)院等單位通力合作，累計(jì)發(fā)表SCI論文100余篇，累計(jì)影響因子（IF）800+，多項(xiàng)重磅文章問(wèn)鼎

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