近日，中南大學(xué)腫瘤研究所熊煒和曾朝陽教授為共同通訊作者，在 Molecular Cancer (IF:?27.401) 期刊發(fā)表了題為“Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2”的研究論文，報道了環(huán)狀 RNA?circRNF13?在鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移中的分子機制。

中南大學(xué)博士生莫勇真、博士后王裕民為共同第一作者。文章中全轉(zhuǎn)錄組測序及分析由歐易生物協(xié)助完成。

?研究背景?

鼻咽癌是一種惡性腫瘤，在東南亞和我國南方地區(qū)高發(fā)。由于其早期癥狀不明顯，鼻咽癌極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。深入研究鼻咽癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移的分子機制，對于鼻咽癌的防治具有重要價值。circRNA 與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，但在鼻咽癌中 circRNA 研究較少。

?研究內(nèi)容?

本研究在鼻咽癌細胞中鑒定到一個新的環(huán)狀?RNA?circRNF13，其在腫瘤組織和鼻咽癌細胞中低水平表達。體內(nèi)和體外實驗表明，circRNF13?可以抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。從機制上講，circRNF13?通過直接結(jié)合 SUMO2 mRNA 的 3’-UTR，延長了 SUMO2 mRNA 的半衰期。上調(diào) SUMO2蛋白水平介導(dǎo) GLUT1 的 SUMO 化和泛素化來促進 GLUT1 降解，通過抑制糖酵解調(diào)節(jié) AMPK-mTOR 通路，最終抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究為進一步闡明鼻咽癌發(fā)病機制和靶向治療提供了重要的理論基礎(chǔ)。

?研究結(jié)果?

1.?circRNF13 在鼻咽癌組織中低表達

對鼻咽癌細胞系進行全轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定到 6,153 個 circRNA。利用 RT-PCR 對表達豐度 top 20 的 circRNA 在鼻咽癌臨床組織（NPC）中進行了驗證，其中?circRNF13?在鼻咽癌組織中表達含量較低，但在正常鼻咽黏膜/上皮組織（NPE）中表達含量更高（圖 A、B）。RT-PCR 也證實，相比于 NPE 細胞，circRNF13?同樣在多個 NPC 細胞系中表達偏低。

Sanger 測序表明，circRNF13?是由 RNF13 基因 2-8 外顯子反向剪接形成的環(huán)狀 RNA（圖 C）。進一步實驗表明，circRNF13?在胞核和胞質(zhì)中均有分布（圖 D-E），并且經(jīng) RNase R 酶處理的 NPC?細胞中?circRNF13?比 RNF13 mRNA 更穩(wěn)定（圖 F）。

圖 1 |?CircRNF13?在鼻咽癌中低表達

2.?circRNF13?在體內(nèi)和體外抑制 NPC?細胞的增殖、遷移和侵襲

在 NPC?細胞中過表達?circRNF13，可以明顯抑制 NPC 細胞的增殖，細胞的遷移能力、侵襲能力也下降。反之，在 NPC 細胞中下調(diào)?circRNF13，可以促進 NPC 細胞的增殖、遷移和侵襲（圖 A-E）。

圖 2 |?circRNF13?抑制 NPC?細胞的增殖、遷移和侵襲

同樣，在裸鼠皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移模型中，circRNF13?過表達可以抑制腫瘤大小，轉(zhuǎn)移也受到明顯抑制；而?circRNF13?敲低?可以促進腫瘤大小和轉(zhuǎn)移。

3.?circRNF13?是通過哪個途徑抑制 NPC 的轉(zhuǎn)移和侵襲？

為進一步研究?circRNF13?在鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移中的分子機制，利用 LC-MS/MS 對?circRNF13?knockdown 的 NPC 細胞進行了蛋白鑒定。結(jié)果顯示，與對照組相比，共 294 個蛋白存在差異表達，其中多個差異蛋白屬于糖酵解途徑。生化檢測結(jié)果表明，過表達?circRNF13?可以引起 NPC?細胞糖酵解能力的顯著下降，而下調(diào)?circRNF13?可以顯著提高細胞的糖酵解能力（圖 A-B）。

之前研究表明，當糖酵解過程被抑制時，細胞內(nèi)的 AMPK 水平被磷酸化激活，活化的 AMPK 通過抑制 mTOR 抑制蛋白質(zhì)的合成和翻譯，進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。WB 檢測結(jié)果顯示，過表達?circRNF13?的 NPC?細胞中 AMPKα 磷酸化水平顯著升高、mTOR 蛋白表達顯著下降，下調(diào)?circRNF13?與之結(jié)果相反（圖 C），并且添加糖酵解抑制劑 2-DG?可以消除?circRNF13?對 AMPKα 磷酸化的影響（圖 D）。以上結(jié)果表明?circRNF13?可能通過抑制糖酵解來抑制鼻咽癌的遷移和侵襲。

圖 3 |?circRNF13?可能通過抑制糖酵解來抑制 NPC?的轉(zhuǎn)移和侵襲

4.?circRNF13?如何抑制 NPC 細胞的糖酵解？

利用 RT-PCR 和 WB 檢測糖酵解途徑中的主要分子，結(jié)果顯示?circRNF13?過表達時 GLUT1?蛋白表達水平顯著降低，circRNF13?下調(diào)時 GLUT1?蛋白表達水平顯著升高，GLUT1 mRNA 表達水平?jīng)]有明顯改變（圖 A-B），提示?circRNF13?可能主要通過影響 GLUT1 蛋白穩(wěn)定性來影響糖酵解。

利用蛋白合成抑制劑 CHX?處理細胞，證實?circRNF13?表達與 GLUT1 穩(wěn)定性存在負相關(guān)（圖 C）。進一步 IP 實驗表明（圖 D），circRNF13?主要是通過介導(dǎo) GLUT1 的泛素化降解來抑制 NPC 細胞的糖酵解。

圖 4 |?circRNF13?通過促進 GLUT1?的泛素化抑制 NPC?細胞糖酵解

5.?circRNF13?又是如何調(diào)控 GLUT1 泛素化的？

對上述 LC-MS/MS 蛋白組數(shù)據(jù)進一步分析發(fā)現(xiàn)， SUMO 蛋白家族成員 SUMO2在LC-MS/MS 蛋白組數(shù)據(jù)中顯著改變。實驗結(jié)果顯示，在鼻咽癌細胞中過表達?circRNF13?顯著上調(diào) SUMO2 的表達，而敲低?circRNF13?可以下調(diào) SUMO2 的表達，與質(zhì)譜數(shù)據(jù)相吻合（圖 A-B）。且在 NPC 細胞中過表達 SUMO2，可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞的糖酵解。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合 RNA pull-down、雙熒光素酶實驗證實（圖 C-E），circRNF13?可以直接結(jié)合到 SUMO2 3’-UTR 區(qū)域，提高了 SUMO2 mRNA 的穩(wěn)定性（圖 F）。

圖 5 |?circRNF13?直接結(jié)合并穩(wěn)定 SUMO2 mRNA 以促進其表達

WB?實驗表明，circRNF13?可以促進 GLUT1 的 SUMO 化修飾。過表達 SUMO2 可以抑制 GLUT1 的表達，促進 GLUT1 的泛素化降解，從而抑制 NPC 細胞的糖酵解過程。以上結(jié)果表明，circRNF13?通過與 SUMO2 結(jié)合調(diào)控 GLUT1 泛素化。

6.?circRNF13?通過 SUMO2?抑制 NPC 細胞的增殖、遷移和侵襲

進一步實驗顯示，過表達 SUMO2 可以挽救由?circRNF13?敲低所介導(dǎo)的 NPC 細胞增殖、遷移和侵襲以及糖酵解的改變（圖 A-D）。同樣，在裸鼠皮下移植瘤模型中，circRNF13?過表達可以引起 SUMO2高表達、GLUT1低表達（圖 E）。表明?circRNF13通過 SUMO2 抑制 NPC 細胞的增殖、遷移和侵襲。

圖 6 |?circRNF13?通過 SUMO2?抑制 NPC?細胞的增殖和遷移

?研究結(jié)論?

本研究在鼻咽癌中鑒定到一個新的低表達 circRNA 分子?circRNF13，它可以作為抑癌因子，直接與 SUMO2 的 3’-UTR 結(jié)合，延長 SUMO2 mRNA 半衰期并上調(diào)其表達，通過介導(dǎo) GLUT1 的 SUMO 化和泛素化促進 GLUT1 的降解，進而抑制 AMPK-mTOR 通路以抑制糖酵解途徑，并最終抑制鼻咽癌細胞的增殖和遷移。

?參考文獻?

Mo Y, Wang Y, Zhang S,?et al.?Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2.?Mol Cancer?2021; 20(1): 112.