艾美捷大鼠實(shí)時(shí)定量PCR DNA損傷分析試劑盒說明書
簡介：這種DNA損傷分析試劑盒用于測定損傷的8.2kb大鼠體內(nèi)和體外的線粒體DNA，在QPCR分析后用實(shí)時(shí)PCR定量復(fù)制的DNA。該試劑盒可對多達(dá)20個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)分析（40個(gè)反應(yīng)）。
?
艾美捷大鼠實(shí)時(shí)定量PCR?DNA損傷分析試劑盒#DD2R組分：
? 2X濃縮QPCR緩沖液（450μL）
? QPCR引物混合物【正向引物和反向引物各2μM】（225μL）
? QPCR檢測DNA[50納克/μL]（10μL）
? 5X增強(qiáng)劑（180μL）
? 8.2 kb實(shí)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)[1ng/uL]（25μL）
? 實(shí)時(shí)引物混合物【正向引物和反向引物各5μM】（100μL）
?
不包括在套件中：
? SYBR Green Mix（可單獨(dú)購買）
? 不含核酸酶的水
? PCR管和蓋
?
DNA損傷分析試劑盒相關(guān)程序分析：
1.QPCR熱循環(huán)儀程序
? 此配置文件的預(yù)編程PCR機(jī)器：
a.98°C，30秒
b.98°C，10秒
c.63°c，10秒
d.72°C，4分鐘
e.30個(gè)循環(huán)（步驟b至d）。
f.72°C，10分鐘
g.4°C
程序：以下程序適用于每20μL的反應(yīng)。增加所有金額
根據(jù)管道總數(shù)成比例。
? 每個(gè)PCR管（20μL Rx），混合以下物質(zhì)：
a.10.0μL 2X QPCR濃縮緩沖液
b.4.0μL 5倍增強(qiáng)劑
c.5.0μL QPCR引物混合物（每個(gè)引物2μM，正向/反向）
d.1.0μL DNA（50納克/μL）
*等分反應(yīng)前的渦流儲備緩沖液
?
2.實(shí)時(shí)PCR程序（用于20μL實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)）
? 建議將來自QPCR的PCR DNA產(chǎn)物稀釋10倍
在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR步驟之前用不含核酸酶的水。
? 混合以下物質(zhì)：
o 10μL SYBR綠色混合物（不包括在試劑盒中）
o 7.1μL H2O（無核酸酶）
o 0.9μL實(shí)時(shí)引物混合物（每個(gè)引物5μM）
o 2.0μL DNA樣本（來自上述QPCR的PCR產(chǎn)物）
? 對于8.2kb的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以下優(yōu)化的DNA濃度為
推薦：
o 2納克/2μL H2O**
o 200 pg/2μL H2O
o 20 pg/2μL H2O
o 2 pg/2μL H2O
o 0.2 pg/2μL H2O
o 0.02 pg/2μL H2O
o 0頁/2m1小時(shí)20分
**8.2kb實(shí)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)
?
推薦的實(shí)時(shí)PCR程序
a） 50攝氏度2分鐘
b） 95攝氏度10分鐘
（程序40個(gè)c和d循環(huán)）
c） 95攝氏度15秒
d） 60攝氏度60秒
計(jì)算：
使用閾值循環(huán)值（CT）和DNA創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線
8.2kb標(biāo)準(zhǔn)品中每一個(gè)的濃度（對數(shù)標(biāo)度）。使用線性回歸
分析，根據(jù)您的CT值確定樣本的DNA濃度
通過PCR獲得。高水平的8.2kb產(chǎn)物代表較少的mtDNA損傷。
?
Detroit R&D整套DNA損傷分析試劑盒可用于人、大鼠或小鼠的血液、細(xì)胞或組織。由于缺失和鏈斷裂造成的DNA損傷可以用此試劑盒檢測，使用微板格式的DNA分離技術(shù)，該試劑盒可以很容易地用于高通量格式。在這方面，Detroit R&D研發(fā)分析是一個(gè)很有前途的工具，因?yàn)榭焖?，操作簡單，只需要少量的測試物質(zhì)。 ??
