一、細(xì)胞樣本的冷凍保存

???新鮮制備的單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活性測定后，可置于冰上暫時保存，以維持細(xì)胞活性。

???向程序降溫盒的內(nèi)夾層倒入250mL異丙醇，注意其它部位不能殘留異丙醇，以防字跡溶解丟失。反復(fù)凍存5次之后應(yīng)及時更換異丙醇，以維持最佳的程序降溫能力。

???在待用的細(xì)胞凍存管外表面以及程序降溫盒外，用記號筆詳細(xì)地標(biāo)注樣本相關(guān)信息和凍存日期時間。

???將待凍存的單細(xì)胞懸液，室溫離心300×g，5min，吸去上清，不要擾動離心管底部的細(xì)胞沉淀。

?? 用凍存保護(hù)液以5×105/mL的密度重懸細(xì)胞。為減少剪切力帶來的細(xì)胞損傷，盡量輕柔緩慢地吹打液體。將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，隨后擰緊凍存管旋蓋。

?? 將裝有樣本的凍存管轉(zhuǎn)移入準(zhǔn)備好的程序降溫盒中，隨后將程序降溫盒保持正面向上，切勿翻轉(zhuǎn)或傾倒放置，于-80℃冰箱中降溫平衡過夜。注：也可直接放入程序降溫儀器中，設(shè)置按照1℃/min的速率降溫（按此降溫速率有利于降低冰晶形成的概率，減少細(xì)胞損傷和死亡）。

???次日取出程序降溫盒，將裝有樣本的凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存，并記錄相應(yīng)的樣本信息和凍存位置信息。

二、細(xì)胞樣本的運(yùn)輸

凍存保存的細(xì)胞樣本：建議置于干冰環(huán)境中維持冷凍運(yùn)輸（-78℃），寄送前請先預(yù)估運(yùn)輸時間，確保運(yùn)輸過程中保留有足夠干冰，運(yùn)輸過程中注意做好緩沖保護(hù)。

三、細(xì)胞樣本的復(fù)蘇

?? 從液氮或干冰中取出凍存管，核對凍存管壁的樣本信息及凍存日期準(zhǔn)確無誤。稍稍擰松凍存管蓋，以確保若凍存管內(nèi)還殘留少量液氮，使其完全揮發(fā)，避免受熱炸裂。

?? 在37℃溫水浴中加熱凍存管，并輕輕晃動以加速解凍過程，直至凍存管內(nèi)的凍存保護(hù)完全融化（確保整個過程在1-2min以內(nèi)完成）。

?? 從水浴中取出凍存管，用酒精棉對凍存管口及外表面進(jìn)行消毒。

?? 將組織樣本連同凍存液一起轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管，加入5mL事先預(yù)熱的細(xì)胞完全培養(yǎng)基，輕柔吸打?qū)⒁后w混合均勻。

?? 室溫離心300×g，5min，吸去上清，不要擾動離心管底部的細(xì)胞沉淀。

?? 加入合適的溶液，輕柔重懸細(xì)胞樣本，用于后續(xù)生物實驗。

四、凍存復(fù)蘇注意事項

???如條件允許，建議可將同一次實驗樣本分多管凍存，以保證實驗成功率。

???組織冷凍保存液中會含有DMSO等有毒性的有機(jī)試劑，操作時請務(wù)必帶佩戴實驗用手套、口罩，并避免皮膚、呼吸消化道以及眼睛直接接觸試劑。

???對生物樣本進(jìn)行凍存復(fù)蘇過程中，會頻繁使用液氮。請佩戴護(hù)目鏡等安全保護(hù)措施，并避免液氮飛濺潑灑，以免燙傷。